194312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új policiklusos éter antibiotikumok és ezeket tartalmazó készítmények előállítására
1 194 312 2 ATCC 39697 tenyésztése és az UK-58,852, CP-70- -228, valamint CP-70828 antibiotikumok Izolálása a korábban poliéter-antibiotikumok fermentálására alkalmazott módszerekhez hasonló módon történik, A fermentálást előnyösen vizes táptalajon, szubmerz aerob körülmények között, keverés közben, 24- 36°C-on végezzük. A fermentáláshoz megfelelő táptalaj hasznosítható szénforrást, mint például a cukrokat, keményítőket és glicerint, szerves nitrogénforrást, mint például kazeint, kazein enzimes lebontott származékait, szójallsztet, gyapotmaghéj tápanyagot, földimogyoró tápanyagot, búzasikért, hús-tápanyagot és hal-tápanyagot tartalmaz. Ugyancsak megfelelően alkalmazható tápanyagok a gabonamag oldható alkotórészei, a haltápanyag, a gyapotmag tápanyag, és az élesztő extraktum, valamint ásványi sók, mint például nátrlumklorid és kálciumkarbonát, továbbá nyomelemek, mint például vas, magnézium, réz, cink, kobalt és mangán. Amennyiben a fermentálás során túlzott habzás tapasztalható, habzásgátló anyagok, mint például növényi olajok vagy szilikonok adagolhatok a fermentléhez. A tartályokban a szubmerz tenyésztés esetében a táptalaj levegőztetése előnyösen egy térfogat fennentlére vonatkoztatva percenként 1/2-2 térfogat steril levegővel történik. Ezt szórófejen keresztül vezetjük a fermentlébe. A keverést a fermentációs eljárásokban szokásosan alkalmazott módon végezhetjük. A keverés sebessége függ az alkalmazott keverőtől. Egy rázóedény rendszerint 150—200 ford/perc sebességgel mozog, míg egy fermentor rendszerint 300—1700 ford/perc sebességgel kever. Természetesen a steril körülményeket fenn kell tartani a mikroorganizmus átoltása és a fermentáció egész folyamata során. A találmány szerinti eljárásban az antibiotikumot termelő mikroorganizmus inokuluma ferde a mikroorganizmussal beoltott tenyészetből vagy Roux edényekből nyerhető. A kezdeti tenyészet számára alkalmas ferde tenyészetben vagy Roux edényben alkalmazható szilárd táptalaj az ATCC no. 172 közeg. A tenyészet alkalmas akár rázóedények, akár inokulum tartályok inokulálására, vagy az inokulum tartályokat a rázóedényekből inokulálhatjuk. A rázóedényekben a növekedés általában 4—5 nap alatt éri cl maximumát, míg az'inokuláló tankokban a szubmerz inokulum 5-6 nap múlva kerül a legelőnyösebb állapotba. A fermentálás során az antibiotikum termelés előrehaladását és a fermentlé bioaktivitását biológiai próbákkal követhetjük. Ezeket Staphylococcus aureus vagy Bacillus subtilis, érzékeny törzseivel, így a B. subtilis ATCC 6633-mal szemben végezhetjük. Standard lemezpróbát alkalmazunk, amelynek során a fermentlével telített szűrőpapír lemez körül kialakuló inhibiciós zónát tekintjük az antibiotikum potenciál mértékének. A fermentáció során keletkező antibiotikum kimutatására ugyancsak alkalmazható szilikagélcn végrehajtott vékonyrétegkromatográfla. Ez alkalmas a nyers és a fermentációs léből extrahált, tisztított anyagok analízisére is. A kromatögramot etilacetát eluenssel fejlesztjük ki és az antibiotikumot vanilin reagens permetezéssel majd a vékonyrétegkromatográfiás lap 80°C-ra való melegítésével tesszük láthatóvá. A kifejlesztett lapot S. aureus vagy B. subtilis törzzsel beoltott agar-agar fölé is helyezhetjük és 16 órán át 37°C-on inkubálhatjuk és így tehetjük láthatóvá az antibiotikumokat. Az Actinomadura roseorufa Huang, sp. nov., ATCC 39697 által a fermentáció során termelt UK-58,852 antibiotikumot a teljes nem szűrt fermentlé szerves oldószerrel, mint például kloroformmal, etilacetáttal, metfl-izobutil-ketonnal, vagy butanollal, a természetesen fennálló pH értéken végzett extrakciója segítségével választhatjuk el. Más eljárás szerint a micéliumot a fermentáció befejezésével elválaszthatjuk a fermentléből, és a micéliumot extrahálhatjuk a szerves oldószerrel. Az oldószeres extraktumot ezután sziruppá bepároljuk és az antibiotikumot kromatográfia segítségével nyerjük ld A CP-70, 228 és CP-70,828 melléktermékeket az anyalúgok további kromatográfiája segítségével nyerhetjük ki. A találmány szerinti eljárásban az antibiotikum elválasztására alkalmazott jellemző eljárás az alábbi: Az Actinomadura ATCC 39697 teljes fermentiert metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az oldószeres extraktum vákuumban történő bepárlásával egy sötét olajat kapunk. Az olajat hexánban oldjuk és szilikagélből készült oszlopra öntjük. A szilikagcl szűrőlepényt ismételten hexánnal mossuk, majd kloroformmal kloroform/etilacetát eleggyel, végül erilacetáttal eluáljuk. Az eluátumokat vékonyrétegkromatográfla segítségével analizáljuk. Az UK-58,852 antibiotikumot tartalmazó frakciókat szárazra pároljuk. A terméket kívánt esetben kristályosítással vagy oszlopkromatográfia segítségével tovább tisztíthatjuk. Az UK-58,852 antibiotikum mellett cikloszerin is keletkezik, de ez kis oldhatósága miatt nem zavarja az UK-58,852 antibiotikum kinyerését. A CP-70,228 és a CP-70,828 melléktermék antibiotikumokat az oszlop további polárosabb oldószerrel történő aluálásával nyerjük ki. A nyersterméket kívánt esetben további kromatográfia segítségével tisztíthatjuk. Ezen túlmenően amennyiben az UK-58,852 antibiotikum szabad sav formáját metanolos oldatban állni hagyjuk, belőle CP-70,228 antibiotikum keletkezik. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumok savas formájúak és bázikus reagensekkel kationos sókat képeznek. Valamennyi ilyen só előállítása beletartozik a szabadalmi leírás tárgykörébe. Ezeket a sókat a poliéter (ionophor) antibiotikumok esetében általánosan alkalmazott eljárásokkal állíthatjuk elő. Például az antibiotikumot illékony, vízzel nem elegyedő szerves oldószerben oldjuk és legalább egy ekvivalens, előnyösen nagy felesleg, megfelelő bázikus reagenst tartalmazó vizes oldattal mossuk. Ezután a szerves oldatot megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A kívánt katinos sót kapjuk. Jellemzően alkalmazható bázikus reagensek az alkálifém hidroxidok, mint például a nátriumhidroxid, a káliumhidroxld, az alkáliföldfém-hidroxidok, mint például a kálciumhidroxid és a báriumhidroxid, valamint az ammóniumhidroxid. Az UK-58,852 antibiotikum ezüst-sójának röntgendlffrakciós analízise, valamint a CP-70,228 és a CP-70,828 antibiotikumok spektroszkópiai analízise szerint a vegyületek szerkezete az alábbi (1) általános képlet szerinti: UK-58,852: R = H, R1 » H CP-70.228: R = H, R1 = CH3 CP-70,828: R = CHj, R1 = CH3 Az UK-58,852 antibiotikum nagyszámú Grampozitív mikroorganizmusa növekedésével szemben fejt ki inhibiáló hatást. Az I. táblázatban összefoglaljuk az in vitro kísérletek eredményeit. A vizsgálat céíjá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
