194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 hez Hgáljuk, míg az ötödik oligodezoxlribonukleotídot a B2 út szeriptí adapteres ligálájsal, a pGCGGGGGGCA GACGyCGCCCCCCGTTÇGAp 3 5 Pstl/Hindin adapter segítségével klónozzuk. Az oligodezoxiribonukleotidok kémiai szintézisét a szilárd fázison végzett foszfát-triészter módszer jelenlegi leggyorsabb változatainak [Efimov V. A. és mtsal., 1982, Nucleic Acids Res. 10, 6675 valamint Sproat B. S. és Bannwarth, W. 1983, Tetrahedron Lett., 24, 5771] alkalmazásával, monomer és/vagy dimer építőegységekből kiindulva végezzük el. Kiindulási vektorokként az M13mp8 [Messing, J. és Vieira J., (1982), Gene, 19 269] és az M13mpl0 [Norrander és misai., (1983), Gene, 26, 101], valamint a laboratóriumunkban konstruált, M13mp8- ból a BamHT és PstI helyek közötti, az eredetinél rövidebb DNS szakasz beépüléséből származó, fehér pakkot adó M13mpW324-et, recipiens E. coli törzsként pedig JM101-et (FtraD36 lacI^Zml5- -proAB) A (lac-ProAB/supE thi) használunk [Messing J. és misai., (1981), Nucleic Adds Res., 9, 309], A Pharmacia P-L. Biochemicals cégtől vásároltuk a kiindulási vektorok közül az M13mp8 replikatív formájú DNS-t (katalógusszám 27-1528-01) és az M13mpl0 replikatív formájú DNS-t (katalógusszám 27-1573-01). A példák során használt enzimek forrásai: A restrikdós endonukleázok a New England Biolabs (NEE), T4 DNS ligáz a Cambridge Biotechnical Laboratory (CBL), DNS polimeráz 1 nagy fragment (Klenow polinieráz) a CBL vagy a Boehringer Mannheim termékd. Az enzimatikus reakciókat, ha külön nem említjük, a gyári előírásoknak megfelelően hajtjuk végre. Az M13mp vektor származékokból replikatív fomiát izolálunk (Bimbóim, H. C. és Doly, J., 1979, Nucleic Acids Res., 7, 1513). A két különböző restrikciós enzimmel végzett hasítások után a vektorokból származó nagy fragmentumot vagy agaróz gélelektroforézissel, s ezt követően elektroeludóval [Manlatis T., Fritsch E. F. és Sambrook J., (1982), Molecular Cloning 164—170 oldal), vagy ammóniumacetátos kicsapással tisztítjuk. Az ammóniumacetátos kicsapás menete a következő: Restrikciós emésztés után a reakdóelegyet, amely mintegy 1 pg DNS-t tartalmaz, 65°C-on 10 percig hőkezeljük, majd desztillált vízzel 100 pl-re kiegészítve, 100 pl fenollal extraháljuk. A vizes fázishoz 10 pl 3 M nátriumacetátot (pH 5,2) és 250 pl etilalkoholt adunk, s gyors fagyasztás (cseppfolyós levegő, 5 perc) után az elegyet centrifugáljuk (12.000 fordulatszám, 5 perc). A csapadékot 100 pl desztillált vízben és 50 pl 7,5 M ammóniumacetátban oldjuk és 200 pl etilalkoholt adunk, az elegyet 15 perdg —70°-ra hűtjük le és a fentiek szerint centrifugáljuk. A kapott csapadékkal az oldást és alkoholos kicsapást megismételjük, a csapadékot 1 ml hideg alkohollal mossuk, szárítjuk és steril desztillált vízben oldjuk fel. Az oligodezoxiribonukleotidok klónozásának általános menete A két alkalmasan megválasztott restrikdós enzimmel. hasított és tisztított vektor (20—50 ng) és az 5 -foszforilezett egyes szálú oligodezoxiribonukleotid vagy az 5 -foszforilezett egyes szálú oligodezoxiribonukleotid és a Pstl/Hindlll adapter ligálásából származó adduktum (2-10 pmol) ligálását 10 pl reakcióelegyben (50 mM Trisz-BCl, pH 7,5, 10 mM MgClí, 10 mM ditiotreitol, 1 mM ATP) 0,2 egység T4 DNS ligáz jelenlétében 15°C-on 12-20 óráig végezzük. 65°C-on, 5 percig végzett hőkezelés után a reakdóelegyet röviden (10-30 másodperc) centrifugáljuk (12 000 fordulatszám) majd 1 pl dezoxiribonukleozid 5'-trifoszfát keverékét, amely egyenkétn 1 mM koncentrádójú dAPT, dCTP, dGTP és TTP nukleotidokat tartalmaz (1 mM dNTP keverék), valamint 1 pl 0,5 egység/pl Klenow polimerázt adunk hozzá. 10 perc szobahőmérsékleten való állás után az elegyet 65°C-on 5 percig hőkezeljük, majd rövid centrifugálás után 4,5 pl steril desztillált vizet, 1 pl 10 mM ATP-t, 1 pl 100 mM ditiotreltolt és 1 pl puffert (500 mM Trisz-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2) adunk hozzá, az elegyet 15°C-ra lehűtjük, és 0,5 pl 2 egység) pl T4 DNS ligázzal elegyítjük. 15°C-on, 12-24 óráig végzett inkubálás után a reakdóeleggyel, JM 101 E. coli sejteket transzformálunk [Dagert M. és Erlich S. D., 1979, Gene, 6, 23, vagy Hanahan D., (1983), J. Mól. Bioi., 166, 557 módszere szerint]. A transzformált sejtszuszpenziót 45°C-on 3 ml fedőagarral X-gal és IPTG jelenlétében TY lemezre öntjük [Winter G. és Fields S., (1980), Nucleic Adds Res., 8. (1965)]. A lemezeket 8-16 óráig 37°C-on inkubáljuk, majd a megfelelő színű plakkokból (8-60 pakk) egyes szálú fág DNS-t izolálunk [Sanger F. és misai, (1981), J. Mol. Biol., 143 161], s ugyanezen módszer szerint végezzük el a fág DNS-ek T- vagy C-mintázat analízisét. Ennek alapján választjuk ki azokat a rekombinánsokat, amelyek a megfelelő méretű DNS szakaszt beépítve tartalmazzák, s ezen rekombinánsok nukleotid-szekvencia analízisét [Sanger F. és mtsai., (1977), Proc. Natl. Acad. Sd., -USA, 74 5463] módszere szerint végezzük el. Az így kiválasztott, megfelelő szekvenciát tartalmazó kiónokból a további munkákhoz kettős szálú replikatív formát állítunk elő. A 35-mer TTTACCACCTTGAGAACTACTGTAACT-AGCCTGCA ligálása Pstl/Hindlll adapterhez 15 pmol 5-31P-foszfát AGCTTGCCCCCCGCT-GCAG és 15 pmol 5’-3íP-foszfát GCGGGGGGCA pligodezoxiribonukleotidókat 10 pl vízben oldvp 30 percig 60°C-on tartunk. Ezután 80 pmol 5 - -32P-foszfát 35-mert (5 pl vizes oldat) adunk hozzá és az oldatot 37°C-on 30 percig tartjuk, majd liofilezzük (6. ábra). A liofllezési maradékot 20 pl pufferben (50 mM Trisz-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM dJtiotrdtol, 1 mM ATP) oldjuk fel és 0,25 pl 2 egység) pl T4 DNS ligázt adunk hozzá, s a ligálást 15°C-on 24 óráig végezzük. 50 pl etilalkohollal való kicsapás és szárítás után a csapadékot 20 rl HlndlII pufferben oldjuk fel s 20 egység HindlII enzimmel 37°C-on 2 óráig állni hagyjuk. A reakdóelegyből a Pstl/Hindlll adapterhez ligáit 35-mert 10%-os nem denaturáló poUakriQamid gélen (400 V, 6-8 óra, szobahőmérséklet) végzett elektroforézissel, s az ezt követő radioatográfia alapján kiválasztott csíkból való eludóval nyerjük ki [Edge M. D. és mtsai., (1981), Nature, 292, 756]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
