194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 1. példa GATCCGGTACCGAGCTCCTGCA 22-mer klónozása M13mp8 repllkatív formát BamHI és PstI enzimekkel hasítunk és a kapott nagy fragmentumot 0,5% agaróz gélen való elválasztás és elçktroeluciô után (körülbelül 25 ng nagy fragment) 5 -foszforilezett 22-merrel (2,5 pmol) ligálunk. A klónozás általános menete szeinti lépések elvégzése után kék színi! háttérben fehér plakkokra szelektálunk. A kapott 70 fehér plakkból 13-at véletlenszerűen kiválasztunk és ezekből egyes szálú fág DNS-t állítunk elő. A T- mintázat vizsgálata alapján a 13 kiválasztott rekombinánsból 9 mutat a beépült 22-merre jellemző eltolódást, s ezek közül nukleinsav szekvencia meghatározása alapján 7 tartalmazza a 22-mer szekvenciáját a BamHI és a PstI helyek között. Az egyik üyen vektor (mpW801) előállítását a 7. ábra mutatja. Az így kapott mpW801-re jellemző, hogy fágként JM101 pázsiton, X-gal és IPTG jelenlétében fehér plakkot ad, repllkatív formája pedig három, egymás mellett lévő, 3’-túlnyúló véget eredményező restrikciós enzim (KpnI, SstI és PstI) felismerő helyét tartalmazza, így a B1 út szerinti ciklusos klónozás kiindulási vektoraként alkalmazható EcoRI és a fenti három restrikciós hely felhasználásával, a 4. ábrához hasonló módon. 2. példa 20, 21 és 22-tagú ollgodezoxiíibonukleotid klónozása, szelekció a 21-mert tartalmazó rekombinánsokra Ez a példa azt mutatja be, hogyan lehetséges egy heterogén oligodezoxiribonukleotid elegyből (20, 21 és 22 tagú elegyből) egy kívánt, adott esetben a 21-tagú komponenst a klónozási módszerünk alapján kiválasztani. Az elegy jellemezhető a C/T//T/TTGGTACCG AGCTCCTGCA képlettel, amelyben CTTGGT ACCGAGCTCCTGCA, CTTTGGTACCG AGCTCCTGC A és CTTTTGGTACCGAGCTCCTGCA ollgodexiribonukleotldok körülbelül ekvimoláris arányban vannak, jelen. Kiindulási vektorként egy mp8 származékot, az mpW324-et használjuk, amelyben az mp8-hoz képest a BamHI és PstI helyek különböző távolságban vannak, s az mpW324-ből származó fág JM101 E. coli pázsiton fehér plakkot eredményez. Az mpW324 replikatív formát BamHI és PstI enzimekkel hasítjuk s a nagy fragmentumot ammóniumacetátos kicsapással izoláljuk. Körülbelül 50 ng nagy fragmentumot a 20, 21 és ^2 tagból álló oligodezoxiribonukleotid keverék 5 -foszforilezett fon újával (10 pmol) az általános menetben leírtak szerint elegyítünk és a klónozási lépeseket is így végezzük el. Transzformálás után kék színű plakkokra szelektálunk, mivel kék színű plakk csak a 21 tagú komponens beépülése esetén várható. 35 kék plakkból 8-at véletlenszerűen kiválasztunk, ezekből egyes szálú fág DNS-t izolálunk s C-mintázat analízist végzünk el. A 8 rekombinánsból kettő C-mintázata olyan, amely 21-tagú oligodezoxiribonukleotid beépülése alapján várható. Szekvenciaanalízis alapján mindkét rekombináns tartalmazza a BamHI és PstI helyek között a 21-mernek megfelelő * szekvenciát. Az egyik Dyen rekombinánst mpB333-nak nevezzük. A többi 6 kék plakk olyan deléciós rekorabinánsokból származik, amelyek a BamHI hçly pollmerizációs feltöltése, valamint a PstI Jiely, 3 -túlnyúló végének a Klenow polimeráz 3 -S' exonukleáz aktivitása következtében történő lehasadása, majd újra ligálás során keletkeznek, s a-komplementációra képes a-peptid származékot kódolnak. (8. ábra). A kapott mpB333 származékra jellemző, hogy fág formában kék plakkot ad JM101 pázsiton (X-gal és IPTG jelenlétében), repllkatív formája pedig három, egymás mellett lévő, 3 -túlnyúló véget eredményező restrikciós enzim (KpnI, SstI és PstI) felismerő helyét tartalmazza, s így az 1. példában leírt mpW801 vektorhoz hasonlóan ciklusos klónozást tesz lehetővé, BamHI, KpnI, SstI és PstI helyek felhasználásával, a B1 út szerint, de másfajta színszelekció alapján. 3. példa CATGTTTGTTAACCAGCACCTGTGCGGCTCT-CCTGCA 39-mer klónozása Az mpW324 replikatív fonnát BamHI és PstI enzimekkel hasítunk, s a nagy fragmentumot ammóniumacetátos kicsapással tisztítjuk. Körülbelül 40 ng nagy fragmentumot és 50 pmol 5-foszforilezett 39-mert az általános menetben leírt lépések alapján reagáltatunk. JM101 E. coli törzsbe való transzformálás után fehér háttérben kék plakkokra szelektálunk. 20 kék plakkból egyes szálú fág DNS-t izolálunk. C-mintázat alapján 19 rekombináns a 39-tagszám beépülését mutatja. 7 ilyen rekombináns szekvenciaanalízisét elvégezve 5 tartalmazza a 39-memek megfelelő szekvenciát. Egy Dyen rekombinánst, amely az emberi inzulin B-láncát kódoló mesterséges gén egy részletét tartalmazza, mpHIBj-nek nevezünk el (9. ábra). 4. példa CATGGGCATCGTTGAACAGTGTTGTACTT-CTATCTGCTCTCTGCA 45-rner klónozása mplO replikatív formát BamHI és PstI enzimekkel hasítunk s a nagy fragment et ammóniumacetátos kicsapással tisztítjuk. Körülbelül 25 ng hasított vektort 10 pmól 5 -foszforilezett 45-merrel az általános menet szerinti reakciósorba viszünk (10. ábra). A reakcióelegyet JM101 E. coli törzsbe transzformáljuk és kék kiindulási vektor-háttérben véletlenszerűen kék rekombinánst szelektálunk. 51 kék plakkból egyes szálú fág DNS-t izolálunk. C- mintázat analízse után az 51 vizsgált klónból 24 a beépült 45-merre jellemző eltolódást mutat, 20 kiindulási mp 10-nek, 7 pedig az előző példához hasonló módon kapott deléciós származéknak bizonyul. A 24 rekombinánsból 14-nek elvégezzük a szekvenciaanalízisét, s ezekből 8 klón a 45-memek megfelelő szekvenciát tartalmazza. Az egyik ilyen kiónt, amely az emberi inzulin A láncának egy részét is kódolja, mpHIAi-nek nevezzük el. 5. példa TTT ACC AGCTTG AG AACT ACTGT A ACT AG-CCTGCA 35-mer klónozása Ez a példa a szintetikus adapter felhasználásával, a B2 út szerinti klónozást Illusztrálja. Az előző, 4. példa során kapott mpHIAJ vektort használva kiindulási vektorként, összekapcsolásra kerül az előzőek5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
