194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 sav szekvenálással, a dldezoxi módszer [Sanger F., Nicklen S. és Coulson A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463] mind a négy reakcióját alkalmazva azonosítjuk. A fág DNS izolálás és a C-mlntázat vizsgálata egyidejűleg nagyszámú (napi 50—60) rekombinánssal történhet. A teljes szekvenálás egyidejűleg 12-20 rekombinánsra alkalmazható. Megjegyezzük, hogy a fentiekben általunk leírt klónozási sereenelés és nukle(nsav szekvencia meghatározás nemcsak Ml3 fág vektorok, hanem hasonló tulajdonságokkal rendelkező plazmid vektorok esetében is úgyanígy alkalmazható. így majdnem teljesen azonos módon kerülhetnek felhasználásra a pUC plazmidok [Vieira J. és Messing J. (1982) Gene 19, 259] és ezek származékai is. Itt nem plakkokat, hanem antibiotikum ampicillin) rezisztens kolóniákat izolálunk a fent leírtakkal teljesen azonos színszelekció alapján. A rekombinánsokból csak kettős szálú formában Izolálható DNS, s ennek a dideoxi módszer szerint végzett szekvenciaanalízise kissé kevésbé megbízható. Ha szükséges azonban, a szekvenciavizsgálat elvégezhető mindkét DNS szálon, két ellenkező irányba mutató univerzális primer segítségével is, Így a végső, a nuldeotidsorrenden alapuló azonosítás ebben az esetben is tökéletes eredményt ad. A pUC plazmidok fenti hátránya mellett előnyként említhető az, hogy az Ml3 vektorokkal szemben stabilabban fenntarthatok, ha hosszú idegen DNS darabot tartalmaznak. Kettős szálú tulajdonságukból következik az is, hogy minden esetben alkalmazható, a színre való szelekció mellett, a beépítendő egyes szálú DNS szakasz radioaktív izotóppal jelzett formájával, mint hibridációs próbával végzett kolóniahidridizációs szelekció is. A találmány szerinti eljárás előnyei: 1. A találmány szerinti eljárás legfőbb jellemzője az, hogy az előállítani kívánt kettős szálú DNS szakasznak csupán az egyik szálát szükséges kémiailag előállítani, s a másik szál szintézise teljes egészében enzimatikusan történik. A végtermék szempontjából felesleges ,szintézisnek csupán az egyes szálú DNS szakasz 3 -végén lévő, a klónozáshoz szükséges öttagú szekvencia előállítása minősíthető. Mivel az a 3 -végszekvencia egy adott restrikciós helyre jellemző, és így többször kerülhet felhasználásra, nagyobb léptékben egyszerre előállítható, s a további specifikus szekvenciák szintéziséhez alapanyagként felhasználható. így például egy kémiai szempontból védett, PstI helyre jellemző szekvencia szilárd fázishoz kapcsolható, s az így kapott hordozó kis részletei kerülnek később felhasználásra. 2. Az egyes klónozási igények során az öttagú, megszabott szekvenclájú DNS szakasz négy tagja utólag eltávolítható, s így a végtermékben nem jelentkezik, mint korlátozó szekvenciarészlet, csu-Eán egy nukleotid, ami a szintetikus DNS darab osszának előzetes, alkalmas megválasztásával a megfelelő helyre illeszthető. A fentiek alapján például: egy 41 bázispárból álló kettős szálú szakasz (82 nukleotid) előállításához elegendő egy 45 tagú egyes szálú DNS darab kémiai szintézise. 3. Előre megtervezhető, hogy az előállítani kívánt DNS két szála közül melyiknek az előállítása célszerűbb kémiai szintézissel. A pirimidin-gazdag DNS . szekvencia kémiai szintézise ugyanis jóvá hatékonyabb, mint a purln-gazdagé. így a megfelelő stratégia a>j(,könnyebb” lánc kémiai szintézise, s a „nehezebb láncnak, enzimatikus és klónozási lépések utáni kinyerése. így célszerű akár egyetlen klónozás] lépés alkalmazásával egy puiin-gazdag szekvencia helyett a komplementer pirimidin-gazdag dezoxioligonukleotidot előállítani, s a puringazdag dezoxioligonukleotidot az 1. és 2. ábra alapján Izolálni, 4. A klónozó vektoron belül az egyes szálú DNS szakaszok összekapcsolása megfelelően orientálva történik, s az egyes szakaszok összekapcsolása után közbenső korlátozó (a klónozáshoz használt restrikciós helyre jellemző) szekvencia nem marad fenn. 5. Az egyes szálú DNS szakaszok klónozása, vektoron belüli összekapcsolása ciklikusosan ismétlődhet. A ciklusok számát az alkalmazott stratégia szabja meg. Ha olyan vektorból indulunk ki, amely halmozottan tartalmaz 3 -túlnyúló végeket eredményező restrikciós helyeket (B1 út, 4. ábra), akkor a ciklusok számát a különböző, ilyen speciflcitású enzimek felismerő helyeinek száma szabja meg. Az adapteres stratégiánál (B2 út, 5. ábra) a ciklusok számának nincs elvi határa. 6. Nincs szükség a klónozandó egyes szálú dezoxioligonukleotid tökéletes tisztítására. A klónozás felfogható, mint végső és teljesen megbízható tisztítási módszer, mivel egyetlen molekula vektorhoz való ligálása és klónozása után kapott rekombináns teljesen homogén szakaszt fog eredményezni. Ez egyben lehetőséget ad arra vonatkozóan, hogy egy heterogén dezoxioligonukleotid populáció egyes tagjai, amelyek egyébként fizikai módszerekkel nem választhatók szét, klónozással külön-külön homogén formában izolálhatok legyenek. 7. A várható rekombinánsok szelektálása, a sereenelés viszonylag egyszerű módszenei elvégezhető. A vektor-gazda rendszer alkalmas megválasztása fenotípikus tulajdonságok (például plakk vagy kolónia színe) alapján is nagy valószínűséggel azonosítja a várható rekombinánst, de ezenfelül egy, az általunk kiválasztott klónozó rendszene előzetesen kidolgozott és széleskörűen alkalmazott nukleinsav-szekvenálás, az úgynevezett didezoxi-módszer lehetőséget ad a kapott rekombináns végső, nukleotid-sonenden alapuló azonosításra. PÉLDÁK A példák során öt egyes szálú szintetikus oligodezoxinukleotid, a GATCCGGTACCGAGCTCCTGCA 22-mer, C/T//T/TTGGT ACCG AGCTCCTGC A 20-21 -22-mer keverék 21- -mer tagja, C ATGTTTGTT A ACC AGC ACCTGTGCGGCTCT - -CACCTGCA 39-mer C ATGGGC ATCGTTG AAC AGTGTTGT ACTTCT AT - CTGCTCTCTGCA 45-mer, TTT ACC AGCTTG AGA ACTACTGT AACT AGCCT-GCA 3 5-mer különféle M13 mp vektorokhoz való ligálását, komplementer száluk enzimatikus szintézisét és a kapott kettős szálú DNS szakaszok klónozását mutatjuk be. Az első négy oligodezoxiribonukleotidot közvetlenül a megfelelően hasított vektor PstI helyé5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
