194307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy kópiaszámú plazmidvektorok előállítására
1 194 307 2 (1983), Murray, N. E., Bruce, S. A., Murray, K.: J. Mol. Biol. 132, 493-505 (1979), Panel, A., Van de Sande, J. H., Loewen, P. C., Khorana, H. G., Raae, A. J., Lillehaug, J. R., Kleppe, K.: Biochemistry, 12, 5045-5050 (1973)]. A DNS polimeráz I enzim Klenow fragmentuma a New England Blo- Labs-től vásárolt, a bakteriális alkallkus foszfatáz (BAP) pedig Worthington preparátum volt. A [y-3 2P] ATP (Magyar Izotóp Intézèt, Budapest) specifikus aktivitása 22 TBq/mM volt. Az YTB táptalaj (Miller, J. H., ed. Experiments in Molecular Genetics., Cold Spring Harbor Lab. New York (1972)] literenként 10 g Bacto Tryptone-t (Difco), 5 g Bacto Yeast extract-ot (Difco) és 5 g NaCl-ot tartalmazott. YTA lemezek készítéséhez az YTB táptalajt literenként 15 g Agar-ral (Difco) eégszítettük ki. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó HB101, C600, ED8800 baktérium törzset 100 pg/ml ampicilllnt (Pharmachlm, Szófia) tartalmazó YTB táptalajon tenyésztettük. Valamenynyi nem pHC plazmid izolálásakor a baktérium kultúrához ODeoonm 0,7-0,8 elérésekor 170 Jüg/ml ldoramfenikolt adtunk és további 10-12 órán át rázattuk. A nagy kópiaszámú plazmidokat (valamennyi pHC származék) amplifikálás nélkül, stacioner fárisig növesztett kultúra sejtjeiből izoláltuk Preparatív méretekben történő plazmid DNS izoláláskor (50-100 ml baktérium tenyészetből a pHC plazmldok, és 1 -3 liter kultúrából minden többi származék esetében) a Clewell és Helinskl által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewel, D. B., Helsinki, D. R. : J. Bacteriol. 110, 1135 (1972)] majd a plazmid DNS-t Sepharcryl SÍ000 (Pharmacia) oszlopon tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálására (1,0-1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowich által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England BioLabs által javasolt reakció-körülmények között történt. Egyesszálú végeket tartalmazó DNS fragmentumok tompa végűvé alakítására a restrikciós enzimmel végzett hasítás után a DNS-t alkohollal kicsaptuk, majd 50 nM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM TTP összetételű pufferben (végtérfogat 10-20 fi, DNS koncentráció 200-250 )tg/ml) oldottuk és 1—2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal 15 percet, 37°C-on inkubáltuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakció elegy (30—40 /4) 0,5-1,0 /üg DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7,6), 5 mM MgCl2-ot, 5 mM dithlothreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység í4 indukált pollnukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2— 3 órán át, 14°C-on végeztük [Maniatis, I., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30—40 Jüg/ml DNS, 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgClj, 5 mM dithlothreitol, 0,25 mM spermldin, 1 mM ATP, 10 ftg/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakdóelegyhez 4—6 egység T« Indukált polinukleotld gázt adtunk és 8—12 órán át 14°C-on Inkubáltuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)]. DNS minták gélelektroforézlsét 0,8-2,0%-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és munkatársai által leírt módon végeztük [Helling, R. B., Goodman, H. M„ Boyer, H. W.: J. Virol, 14, 1235 (1974)]. A pollakrilamld gélelektroforézís•— 4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertilálls géleket alkalmazva - a Maniatis és munkatársai által közölt recept szerint - történt [Maniatis, T., Jeffrey, A., Van de Sande, H.: Biochemistry, 14, 3787-3794 (1975)]. DNS fragmentumok izolálására agaróz és poH- akrilamid gélekből Winberg és munkatársai [Winberg, G., Hammarskjöld, M. L.: Nucleic Acids Res. 8, 253—264 (1980)] DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk. Kompetens sejteket a HB101, C600 és ED8800 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Mandel, M., Higa, A.: J. Mól. Bioi., 53, 154 (1970)], CaCl2-os eljárással készítettük. , DNS fragmentumok 5 -végeinek defoszforilálása, végjelölése polinukleotid kinázzal és [73 2 3] ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározására a Maxam és Gilbert által leírt protokol szerint történt [Maxam, A. M., Gilbert, W.: Methods Enzymol.65,499(1977)]. A találmány az eljárásokon kívül olyan nagy kópiaszámú plazmidvektorokra is vonatkozik, amelyek a plazmidreplikáció represszorának termeléséért felelős génben egy a funkcionálisan ép represszor szintézisét módosító mutációt tartalmaznak. A találmány szerinti plazmldok előnyös képviselőit az jellemzi, hogy a pBR322 vagy ezzel azonos replikádós régióval rendelkező plazmidok és származékaik mutációt tartalmaznak a plazmidreplikádóban represszor funkciót betöltő RNS-t kódoló génben és nem, Ínaktivált vagy mérsékelten működő formában tartalmazzák a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént. Különösen előnyösek azok a találmány szerinti nagy kópiaszámú plazmidvektorok, amelyek a pBR-322-vel azonos replikádós régiót, a replikádós represszorként működő kis RNS génjében G—T pontmutádót és a) szelektív genetikai markerként a pBR322 plazmid ampicillln rezisztencia génjét tartalmazzák, és szerkezetükben Inaktivált vagy hiányzik a tetraciklin rezisztenda gén, vagy b) szelektív genetikai markerként a pBR322 ampicfflin és tetraciklin rezisztencia génjét tartalmazzák, és bennük a Tj rezisztenda gén transzkripdója a természetestől gyengébb mutáns vagy idegen promoterről folyik. A 3., 4. és 5. ábrákon szemléltetett plazmldok a találmány szerinti nagy kópiaszámú plazmidvektorok előnyös képviselői, amelyek jellegzetes tulajdonságai a következők: 1. A replikádós represszorként működő klsmolekulasúlyú RNS génjében végrehajtott változtatás következtében replikádójuk derepresszált, ezért a sejten belüli kópiaszám jelentősen megnőtt, 1000 körül van. Ez a magas kópiaszám a gazdasejtjént használt E. coll sejtek növekedési rátáját nem befolyásolja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
