194307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy kópiaszámú plazmidvektorok előállítására
1 194 307 2 2. Az egyes plazmldok számos restrikciós endonukleáz hasítási helyeit tartalmazzák, ami lehetővé teszi, hogy az adott enzimekkel, azok kombinációjával, vagy más, de azonos véget képező endonuídeázzal hasított DNS-fragmentumok egyszerűen beépíthetők ezekbe a plazmidokba. Klónozásra alkalmas hasítási helyek az egyes plazmidokban: pHC 314: Clal, Hindin, Xbal, BamHI, Bglü illetve ezek tetszőleges kombinációi, pHC 312: Clal, Hindni, Xbal, BglII, EcorI illetve ezek tetszőleges kombinációi, pHC 624: EcoRI, Hindin, BamHI, Xbal, BglII, Smal, (Xmal), Sáli illetve ezek kombinációja néhány megszorítással. 3. Méretük jóval kisebb, mint a kiinduló pBR322- -é, így a 3., 4. és 5. ábrákon bemutatott plazmldok mérete sorrendben 2405bp, 2010bp illetve 20l5bp. Ez azért előnyös, mert a legtöbb vektorplazmid sejten belüli kópiaszáma a plazmid méretével fordítottan arányos. A génklónozási kísérletekben annál nagyobb géneket lehet jó hatásfokkal klónozni, minél kisebb a vektor. 4. Rendelkeznek az eredeti pBR322 ampicfllln-rezisztencia génjével mint szelektív genetikai markerrel. 5. Rendelkeznek az eredeti pBR322 replikációs kezdőpontjával. A találmány szeint előállított nagy kópiaszámú plazmidvektorok felhasználására változatos lehetőségek vannak. Bármely klónozott szakasz, illetve a teljes chimaera plazmid tiszta előállítása ellenőrző vizsgálat, szerkezetbizonyítás, módosítás, átklónozás stb. céljából. A találmány szerint előállított plazmidok alkalmazása esetén lényegesen kevesebb — a példaszerűen bemutatott pHC plazmidoknál mintegy 20-30-szor kevesebb - kiindulási anyagból nyerhető azonos mennyiségű DNS, mint az általában használt plazmidoknál. pHC plazmidokat hordozó baktérium egyetlen — agarlemezről levett - kolóniájából elegendő plazmid DNS preparálható 3—4 restrikciós analízis számára. Egy liter baktériumkultúrából 10 mg-nál több tiszta plazmid nyerhető ki. Amennyiben a klónozott gén termékének megnövekedett produkciója elviselhető a gazdasejt számára, bármely géntermék fokozott szintézise elérhető pHC plazmiddal. Optimális esetben a hozamfokozás mintegy 20—30-szoros, mert körülbelül ekkora az elérhető géndózis-emelkedés. A gyakorlatban esetenként változó mértékű, egyes esetekben némileg kisebb lehet az emelkedés, mert valamely más faktor válhat limitáló tényezővé. Valamilyen fokozás azonban minden esetben várható. A polflinker részt tartalmazó plazmidoknak ez a szakasz nagy hajlékonyságot kölcsönöz. Amennyiben a klónozandó gén számára a rendelkezésre álló hasítóhelyek nem megfelelőek, lehetőség nyílik azok kicserélésére, vagy szintetikus adapterekkel más fragmentumokkal való klónozásra alkalmassá tételére. Fontos felhasználási lehetőség a vazopresszln, inzulin stb. termelés. Hangsúlyozzuk, hogy a találmányunk szemléltetésére szolgáló kísérletek leírása nem korlátozó jellegű, a találmány megvalósítására számos alternatív lehetőség létezik. így például mód van arra, hogy az Fnu4HI illetve Tthi II enzimek alkalmazásával kivágjuk a pBR322 plazmidból a megfelelő helyet tartalmazó, 21 illetve 23 nukleotidból álló DNS szakaszt, és ezek G—T pontmutációt tartalmazó formáját kémiai úton megszintetizáljuk, mad visszaépítsük a pBR322 molekulába. Ugyanígy a legkülönbözőbb szintetikus eredetű polflinker DNS szakaszok beépíthetők a részben vagy egészben eltávolított, a tetraciklin-rezisztenciáért felelős DNS helyére. Mindezek és más, hasonló megoldások és az ezekkel kapott plazmidok szintén találmányunk tárgykörébe tartoznak. A pHC312, pHC314 és pHC624 plazmidokat az Országos Közegészségügyi Intézetnél (OKI) 1984. március 7-én 00279, 00280 illetve 00281 MNG számon letétbe helyeztük. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a pBR322, származéka, vagy ezzel azonos replikációs régióval rendelkező plazmidok nagy kópiaszámú származékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a pBR322-ben, származékában, vagy ezzel azonos replikációs régióval rendelkező plazmidban a tetraciklin-rezisztenciát okozó membránfehérje termeléséért felelős gént inaktiváljuk, vagy működését csökkentjük, és az így kialakult származékban a represszor RNS-t kódoló génszakaszon a represszor termelését módosító G—T pontmutációt hozunk létre, és kívánt esetben a tetraciklin-rezisztenciát okozó membránfehéije termeléséért felelős DNS szakaszt egy vagy több lépésben egy szintetikus eredetű polflinker DNS-sel helyettesítjük. (Elsőbbsége: 1983.09.16.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a represszor RNS-t kódoló génszakaszon a pBR322 eredeti számozása szerinti 3074. pozícióban G—T pontmutációt hozunk létre. (Elsőbbsége: 1983.09.16.) 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás a z - zal jellem ezve, hogy a G—T pontmutációt okozó membránfehéije termeléséért felelős bNS szakaszt egy több fontos restrikciós enzimmel hasító szintetikus eredetű polflinker DNS-szakasszal helyettesítjük, vagy a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génbe idegen DNS-darabot építünk, ami azt inaktiválja, vagy lecsökkentjük a tetraciklin rezisztencia gén átírását a protomer régióban képzett mutációval, illetve a természetes protomert egy kevéssé intenzív transzkripciót biztosító idegen Írotomerrel helyettesítjük. (Elsőbbsége: 1983 . 09. 6.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás a 3. ábra szerinti pHC314 plazmid (MNG00280) előállítására, azzal jellemezve, hogy az amprtets fenoltípusú, pHCl elnevezésű PBR322 vektor-származékot EcoRI és PvuII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, az egyszálú végeket feltöltjük, a szálat cirularizáljuk, E. coli HB101-be transzformáljuk, és a kiválasztott transzformánsokból plazmidot izolálunk, a plazmidok közül a restrikciós enzimes elemzés alapján a PvuII-vel nem hasadó és EcoRI-gyel H- neaiizálódó, 2. ábra szerinti pHC81 plazmidot kiválasztjuk, ezt EcoRI-gyel linearizáljuk, a linearizált plazmidot alkáilkus foszfatázzal defoszforflezett, EcoRI enzimmel emésztett trvx plazmid DNS-sel Ágáljuk, a ligálási keverékkel E. coH HB101 sejteket transzformálunk, az Ap rezisztens baktériumtelepekből plazmid DNS-t izolálunk, és a plazmidok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
