194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 és amelyek képesek bizonyos gazdasejtek megfertőzésére és a sejten belüli fennmaradásra. Expressziót ellenőrző szekvencia Operatív módon a strukturális génekhez hozzákapcsolódva a strukturális gének expresszióját ellenőrző és szabályozó nukleotid szekvencia. Idetartoznak a lac- és trp-rendszerek, a X-fág fő promoter és operátor régiói, az. fd burkoló fehérje ellenőrző régiói, és egyéb olyan szekvenciák, melyek prokarióta és eukarióta sejtek, valamint vírusaik gén expresszióját ellenőrzik. Az 1. ábrán olyan rekombináns DNS molekulák keverékének előállítási eljárását mutatjuk be, amelyek valamelyikének inszert DNS szekvenciája humán leukocita interferon biológiai vagy Immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptideket kódol. " Humán interferon mRNS-t tartalmazó poli(A)RNS előállítása ' Humán leukocitákat 5 órán át 37°C hőmérsékleten Sendai vírusokkal kezelünk, majd extrakcióval humán leukocita interferon mRNS-t (HuIFN-amRNS) tartalmazó poli(A) RNS keveréket kapunk. Az indukciót Cantell-inódszerrel végeztük (The Interferon System, 180—31. o., továbbá az ottani citátumok). A poli(A)RNS keveréket — aktuális arányaira való tekintet nélkül — az 1. ábrán illusztráljuk. Az indukált leukocitákat összegyűjtjük, majd I011 sejtet 8 g NaCl-t, 0,2 g KCl-t, 1,15 g Na2 HP04 . 2H2 O-t, 0,2 g KH2P04 -t és 1 liter vizet tartalmazó (PBS) oldat 1 literében újraszuszpendálunk és erős keverés közben lassan 17 1 20 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5), 1 mmól/liter EDTA-t (TE-puffer), 2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldatba öntjük, amely 50 1-es választótölcsérben helyezkedik el. 200 jug/ml koncentráció eléréséig ön-emésztett pronázt (Calbiochem) adunk hozzá, és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. A poli(A)RNS kinyerése és a rákövetkező lépések alatt az mRNS degradáció ellenőrzése jelzésének céljából 10® beütés/perc (cpm) mennyiségben líSI-globin-mRNS-t adunk hozzá. A teljes térfogat 1/20-ad részével egyenlő mennyiségű 2 mólos Trisz-HG-t (pH = 9) (1/20 rész) adunk hozzá, majd 10 percen át 15 1 újradesztillált fenollal erős keverés közben extraháljuk. 3 liter kloroformot adunk hozzá, és a keveréket 5 percen át kevertetjük. 30 percet — a fázisok elkülönülése céljából — állni hagyjuk, majd a fázisokat elválasztjuk, és a vizes fázist ismét fenollal, majd kloroformmal extraháljuk. A kapott vizes fázishoz — melynek térfogata 19,1 1, 60 g SDS-t adunk. A vizes fázist 1/10- ed térfogatnyi 3 mólos nátrium-acetáttal (pH = 5,5) és 2 térfogatnyi etanollal kezelve a nukleinsavakat kicsapjuk. Éjjelen át -20°C-on tartjuk, és a széles kivált rostos nukleinsavat műanyag teaszűrőn át történő szűréssel eltávolítjuk. A kapott anyagot 200 ml TNE-t (50 mmól/liter Trisz-HCl (pH = 7,5)), 100 mmól/liter NaG 5 mmól/liter EDTA) és 0,5% SDS-t tartalmazó oldattal keverjük, majd az előző oldat további 350 ml-ében ismét feloldjuk. A nem szálas szerkezetű csapadékot 1 literes Sorvall palackban Sorvall RC-3 centrifugával 15 percen át 5000 fordulat/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, és 350 ml 0,5% SDS-t tartalmazó TNE oldatban feloldjuk. A két TNE-oldatot egyesítjük, 1 térfogat6 2 rész fenollal háromszor, háromszor 1/2 térfogatrész éterrel, majd háromszor 1 térfogatrész éterrel extraháljuk. így a vizes fázisból 775 mg RNS-t kapunk (260 nm-nél mért adszorpció alapján). Poli(A)RNS keveréket oligo(dT)cellulózhoz (7-es típusú P L Biochemicals, Inc.) történő ismételt adszorpcióval különítjük el. 2,7 g digo(dT)cellulózt 500 ml fenti oldathoz - azaz az RNS-t tartalmazó oldat feléhez - adjuk. A poli(A)RNS-nek az oligo-(dT) cellulózhoz történő adszorpciója elérése céljából 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a cellulózt, a hozzákötött mRNS-ek keverékével együtt, centrifugálással elkülönítjük és 50 ml TNE-vel, majd 15 ml TNE-vel mossuk. A kötött poli(A)RNS-t öt egymást követő vizes mosással (2 ml) eluáljuk. Optikai sűrűsége alapján 860 p% poll(A)RNS-t kapunk (A termék). A felülúszó RNS oldatot — melyet az első adszorpcióval kapunk — két további adszorpciós ciklusba visszük be, az elsővel azonos módon. A második és harmadik adszorpciós ciklusból 600 pg ill. 170 jug RNS-t kapunk, melyeket egyesítünk (B termék). HuIFN-amRNS hatás vizsgálata céljából az RNS-t Xenopus laevis oocitákba injektáljuk (The Interferon System, 93-95. o.) a következő módon: 15 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5) és 88 mmól/ /liter NaCl-t tartalmazó (TNK puffer) oldatban kb. 1 mg/ml koncentrációban az RNS-t feloldjuk. A kapott oldat 50-50 nl-ét 50 oocita mindegyikébe injektáljuk, és az oodtákat Barth táptalajon [Gurdon, J. Embryol and Exper. Morph., 20, 401-414. o. (1968) és Barth, J. Embryol and Exper. Morph., 7, 210-222 o. (1959)] éjjelen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubált oocitákat átöblítjük és 1,5 ml-es Eppendorf centrifuga csőben 0,5 ml 52 mmólos Trisz-glidn puffénál (pH = 8,9) Pasteur pipetta segítségével homogenizáljuk. Eppendorf centrifugában 2 percen át centrifugáljuk, a felülúszót leválasztjuk, és —20°C-ra hűtjük vizsgálata céljából. Az IFN-a hatást M. Strander és K. Cantell módszerével (production of Interferon By Human Leukocytes In Vitro”, Ann. Med. exp. Fenn., 44, "265-73. o. (1966)), plakk-csökkenési vizsgálattal határoztuk ideg. Egy egységnyi IFN-a a vírus-plakkokat 50%-kal csökkenti. Az IFN-a preparátum hatását HuIFN-a 69/19-re (International Symposium on Standardization of Interferon Inducers, 1969), vonatkoztatva fejezzük ki. Egy másik lehetőség, hogy a hatást a citopatiás hatás csökkentése alapján határozzuk meg, lényegében W. E. Stewart és S. E. Sulkin módszere [„Interferon Production In Ijamsters Experimentally Infected With Rabies Virus , Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 123, 650—3. o. (1966)] szerint, attól annyiban eltérve, hogy humán CCL-23 sejteket és Mengo-vírust használunk. Az oocita extraktum az injektált RNS pg-jaira számítva 300 NE IFN-a hatással rendelkezik. 48 óra múlva csak az inkubációs közeget vizsgáljuk, mivel az oociták az interferont kiválasztják [A. Colman és J. Mörser, „Export of Proteins From Oocytes Of Xenopus laetds”, Cell, 17, 517- 26. o. (1979)]. A poli(A)RNS további tisztítása céljából a poli(A)RNS A preparátumához annyi 0,5 mólos etilén-diamln-tetraecetsavat (EDTA) adunk, hogy 5 mmólos EDTA koncentrádójú oldatot kap-194 305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
