194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 junk. A kapott oldatot kétszer azonos térfogatú TNE-vel telített fenollal és ötször azonos térfogatú éterrel extraháljuk. Majd 0,1 ml-Chelex-100 Bio-Rad oszlopon engedjük át, és 100°C-on 90 percen át hevítjük és 13 ml - 50 mniól/liter Trisz-HG-t (pH = 7,5). 1 mmól/liter EDTA-t, és 0,2 műl/liter NaG-t tartalmazó — 5-23%-os répacukor gradiensre rétegezzük. Hind Hl és Pst I (New England Biolabs) restrikciós enzimekkel emésztett pBR322-ből előállított, az 5 terminálison 32p-vel jelzett (10000 beütés/perc (cpm)) DNS fragmenseket adunk hozzá méret-jelzőként. Ezután SV40 rotorral 10°C-on és 35 000 fordulat/perc fordulatszámmal 16 órán át centrifugáljuk. ISCO gradiens gyűjtővel 1 ml/perc áramlási sebességgel 0,6 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az egyes frakciók HuIFN-amRNS hatását a fentiekben ismertetett módszerrel megvizsgáljuk és a 32P-DNS jelzőre vonatkoztatott helyzetüket feljegyezzük. A következő centrifugálások során a HuIFN-a-mRNS-t tartalmazó frakciókat a jelzőkre vonatkoztatottan azonosítjuk. A HuIFN-amRNS hatású frakciók 80 jug poli(A)RNS-t tartalmaznak. Kétszeres térfogatú, 0,5% SDS-t és 0,02% polivinil szulfátot (a későbbiekben a polivinil-szulfátot elhagyjuk) tartalmazó TNE-vel keverjük össze és 50 /d-es oligo (dT) cellulóz oszlopra visszük. Az oszlopot a fentiekben ismertetett módon mossuk, és négy 0,6 ml steril desztillált vízzel való mosással 40 /tg RNS keveréket eluálunk. Etanollal történő leválasztás után a kapott RNS-t 1 mg/ml koncentrációban 0,5 nimólos EDTA-ban feloldjuk. A leválasztott poli(A)RNS egy részét HuIFN-űmRNS hatás szempontjából vizsgáljuk, a fentiekben ismertetett módszerrel, és az eredmény 3600 NE interferon) pg injektált RNS értéknek adódik. így tehát a répacukor gradiens a HuIFN-amRNS vonatkozásában a poli(A)RNS-t kb. tízszeresre dúsítja. Egy újabb kísérletben kb. negyvenszeres dúsítást tapasztaltunk. A B preparátumot hasonló módon tisztítjuk, és fajlagos hatása azonos az A preparátuméval, így A-t és B-t egyesítjük. A répacukor gradienssel kapott poli(A)RNS sokféle mRNS-t tartalmaz.' Az IFN-a^ra fajlagos mRNS-t kivéve, a többi mRNS nemkívánatos komponens (1. ábra). Sajnálatos módon a szennyező mRNS-ek a HuIFN-amRNS-hez hasonló tulajdonságúak végig a találmány szerinti klón-képzési eljárás során. így G' lenlétük a poli(A)RNS-ben olyan nagyszámú nemvánt bakteriális klón előállítását eredményezi, melyek az IFN-a-tól eltérő polipeptideket kódoló géneket tartalmaznak. E szennyezés továbbá komplex szkrinelési problémát jelent a kívánt IFN-a hibrid kiónok elkülönítése során. Az IFN-a esetén a szkrinelést tovább nehezíti az a tény, hogy kívánt kiónok azonosításául szolgáló, megfelelő tisztaságú Hull N-am RNS vagy DNS vagy ezek részlete nem áll rendelkezésünkre. Ennél fogva az IFN-a kiónok szkrinelése meglehetősen időigényes és nehézségekbe ütközik. Tovább, mivel várhatóan az IFN-a kiónok csak igen kis százaléka fejez ki biológiailag vagy immunológjaflag hatásos IFN-Ort, így e hatásos kiónok elkülönítése hasonló nehézségű, mint egy ,íű megkeresése egy szénakazalban’. Előnyösen tisztított HuIFN-amRNS vagy cDNS vagy ezek részletének előállítását rekombináns DNS eljárással valósíthatjuk még. E tisztított mRNS-t vagy çDNS-t nagyszámú bakteriális klón gyors szkrinelésére használhatjuk, Dymódon jelentősen megnövelve a valószínűségét IFN-Ort hatásos formában kifejező klón elkülönítésének. HuIFN-acDNS-t tartalmazó cDNS keverék szintézise Egyláncú komplementer DNS (cDNS) előállításának templátjaként IFN-amRNS-ben dúsított poli(A)-RNS-t (A+B preparátumok) használunk (1. ábra) (v. ö. A. Efstratiadis és társai, „Full Length And Discrete Partial Reverse Transcript Of Globin And Chorion mRNAs , Cell. 4, 367-78. o. (1975) és az ott megadott hivatkozások). A 800 ß térfogatú reakcióelegy 40 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5), 30 mmól/liter NaG-t, 5 mmól/liter MgG2-t, 0,5 mmól/liter DTT-t (Cal-Biochem), 20 pg/tnl koncentrációban oligot(dT) 12-18-t (P et L Biochemicals), 5 mmól/liter dGTP-t (Schwarz), dCTP-t (Laevosan) és dTTP-t (Sigma), valamint 5 mmól/liter 32P-dAPT-t (NEN, 100 000 cpm/nmól specifikus aktivitású), 60 jug/ml koncentrációban poli(A)RNS-t és 280 egység madár mieloblasztózis vírus (AMV)-reverz transzkriptázt (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida) tartalmaz. 37°C-on 1 óra hosszat tartó inkubáció után annyi 0,5 mólos EDTA-t és 20%-os átkristályosított SDS-t adunk hozzá, hogy EDTA-ra 10 mmólos ül. SDS-re 0,1%-os legyen. Ezután a reakcióelegyet 1 térfogatrész desztillált fenollal extraháljuk. A feno- Ios fázist azonos térfogatú éterrel (Fluka, pa.) extraháljuk és 5 ml-es Sephadex G-100 oszlopon (TNE) kromatografáljuk. 0,3 ml/perc eluátum sebesség mellett 0,1 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A radioaktív frakciókat (Cerenkov) sugárzás "The International Dictionary of Physics and Electronics, D. Van Nostrand Co., Inc. Toronto, New York, London, 1956, 138. oldal] alapján mérjük) egyesítjük és 3 mólos nátrium-acetát oldatból annyit adunk hozzá, hogy nátrium-acetátra vonatkoztatva 03 mólos olatot kapjunk. A nukleinsavakat 2,5 szeres térfogatú etanollal csapjuk ki. Éjjelen át —20°C hőmérsékleten tartjuk, majd centrifugáljuk és a felülúszót eldobjuk. A csapadékot 180 ß desztillált vízben feloldjuk és szilikonozott Eppendorf csőbe helyezzük, majd 20 (A 5 mólos NaOH-t adunk hozzá és szobahőmérsékleten 40 percen át tartjuk. Ezután 20 (A 5 mólos nátrium-acetátot, 100 ß desztillált vizet és 500 ß etanolt adunk hozzá. Éjjelen át -20°C hőmérsékleten tartjuk, a kivált csapadékot 20 percen át 0°C-on a nehézségi erő tízezerszeresével (10000 x g) centrifugálva elkülönítjük, így 10 /tg egyláncú cDNS-t kapunk. Hangsúlyoznunk kell, hogy a fenti módon előállított egyláncú cDNS nagyszámú különböző, a poli(A)RNS keverékben lévő megfelelő mRNS-ekből átírt cDNS-ek keverékében van jelen (1. ábra), melyek közül csak nagyon kevés vonatkozik az IFN-q-ra, vagyis csak kevés HuIFN-acDNS. A másik tényező, mely a cDNS keveréket bonyolultabbá teszi, abból ered, hogy a poli(A)RNS keverék mRNS tagjai nem teljes egészében hódnak át, hanem a transzkripció megállhat még mielőtt az mRNS véget ér. így mindegyik mRNS specieszből különböző cDNS-ek keletkezhetnek (ezeket az 1. ábrán nem tüntettük fel). Valamennyi speciesz többé-kevésbé hasonlóan viselkedik a klón-képzés során, tehát olyan bakteriális kiónok keletkeznek, amelyek az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
