194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 lût helyzetét — a 4. ábrához képest - pontosabban ábárzolja. 11. ábra Találmány szerinti rekomblnáns DNS molekula két DNS lnszertjének restrikciós térképét hasonlítja össze. 12-16. ábra Találmány szerinti rekomblnáns DNS két lnszertjének nukleotíd szekvenciáját ismerteti. A szekvencia számozás 5’ pollG-véget követő nukleotidtól a poil A és 3 poliC vég előtti nukleotidlg tart. Az inszertek amlnosav szekvenciája a fenti (nukleotíd szekvenciáját kis betűkkel írtuk le.) Az „érett” interferon aminosav szekvenciája a fenti (nukleotíd szekvenciáját nagy betűkkel írtuk le). 17. ábra Z-pBR322 (Pst) /HcIF-II-206 részleges restrikciós térképét mutatja be, valamint a 12- 16. ábrán feltüntetett Hif~II-206 fragmens nukleotíd szekvenciájának meghatározásánál alkalmazott stratégiát ismerteti. 18. ábra Hif-2h fragmenshez hibridizáló hibrid fágok részleges restrikciós térképét mutatja be. 19. ábra Z-pBR322 Pst/HchrIF-35HBd hibrid inszert részleges restrikciós térképét, valamint a nukleotíd sorrendjének meghatározásában alkalmazott stratégiát szemlélteti. 20-23. ábra HchrIF-35HBa fragmens nukleotidot és a belőle szánnazó aminosav szekvenciát ismerteti. 24. ábra HuIFN-o-ra vonatkozó gének részleges kapcsolódási vázlatát szemlélteti. A nyilak azokat a régiókat jelzik, melyek az indukált leukocita poli(A) RNS-sel R- hurkokat képeznek. A satírozott rész (chr- 16) a folt-kísérletekből kapott szekvenciát mutatja, amely az R hurok vázlaton nem volt feltüntetve. 25. ábra C8-JFN-a plazmid szerkezetét ismerteti. 26. ábra LAC-AUG(a2) plazmid szerkezetét ismerteti. 27. ábra LAC-AUG(a2) megalkotásában az AUG beindító kodonjainak rekonstruálását valamint a CYS indító kodont szemlélteti. 28. ábra C8-1FN-02 plazmid és az I. II. ül és IV hibrid molekulák megalkotásának sematikus vázlatát mutatja be. 29-32. ábra IFN-24b-t kódoló nukleotíd szekvenciát valamint az ezáltal kódolt aminosav és szignál-szekvenciát ismerteti. A leírásban használt kifejezéseket a következőképpen értelmezzük: Nukleotíd DNS vagy RNS monomer egysége, mely cukorrészből (pentózból), foszfátból és egy nitrogéntartalmú heterociklusos bázisból épül fel. A frázis a cukor glikozidos szénatomjához (a pentóz 1 szénatomjához) kapcsolódik. A bázis és cukor összetevő a kombinációját nukleozidnak nevezzük. Valamennyi nukleotidot bázisa jellemzi. A négy DNS bázis a következő: adenin (A), guanln (G), citozin (C) és timin (T), míg A, G, C és uracil (U) képezi a négy RNS bázist. DNS szekvencia Nukleotidok olyan lineáris sorozata, amelyben az egyes nukleotídokat a pentóz-részek 3’ é* 5* szénatomjai közötti foszfodiészter kötések kapcsolják Össze. Kodon Három nukleotíd (triplett) DNS szekvenciája, mely mRNS-en keresztül egy aminosavat, start jelet vagy terminációs jelet kódol. Például a TTA, TTG, CTT, CTC és CTG tripletek leucin aminosavat (Leu), TAG, TAA és TGA tripletek stop jelet, az ATG triplet pedig start jelet kódol. Leolvasó keret Kodönok csoportosítása az mRNS aminosav szekvenciára történő lefordítása alkalmával. A lefordítás alatt biztosítani kell a helyes leolvasást. Például GCTGGTTGTAAG szekvencia három leolvasó keretben csoportosítható, amelyek különböző aminosav szekvenciáknak felelnek meg: GCTGGT TGTAAG—Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTTGTA AG -Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G-Trp-Leu-(STOP) Polipeptid Aminosavak olyan lineáris sorozata, amelyben az egyik aminosav a másikhoz az egyik aminosav aamino- és a másik aminosav karboxflcsoportja közötti peptídkötésekkel kapcsolódik. Genom A sejt vagy vírus teljes DNS-e, Többek között magában foglalja a szubsztancia polipeptidjeit kódoló szerkezeti géneket, az operátort és promotert, riboszóma kötési és interakciós szekvenciáit, mint például a Shine-Dalgarno szekvenciákat. Szerkezeti gén Specifikus polipeptidre jellemző aminosav szekvenciát templátján vagy hírvivő (messenger) mRNS-en keresztül kódoló DNS szekvencia. Átírás (Transzkripció) Szerkezeti génből mRNS keletkezése Lefordítás mRNS-ből polipeptid keletkezése Expresszió A transzkripciót és lefordítást foglalja magában, vagyis szerkezeti génből polipeptid keletkezését jelenti. Plazmid Nem-kromoszomális kettősláncú DNS szekvencia, mely intakt replikont tartalmaz, olyant, mely a gazdaszervezetben a plazmidot Tepllkálja. Ha a plazmidot egysejtű szervezetbe helyezzük, a plazmid DNS-ének megfelelően a szervezet jellemzői megváltozhatnak vagy transzformálódhatnak.R így például a tetraciklin rezisztenciáért (TetK-ért) felelős gént tartalmazó plazmid a tetraciklinnel szemben korábban érzékeny sejtet a tetraciklinre rezisztenssé teszi. A sejtet, amelyet a plazmid átalakít, transzformánsnak nevezzük. hág vagy bakteriofág Bakteriális vírus, számos közülük fehérjébe burkolt vagy feltétjével bevont DNS szekvenciákból épül fel (tok). Klón-hordozó Gazdasejtben replikádéra képes plazmid, fág DNS vagy más DNS szekvenciák, melyek egy vagy néhány endonukleáz felismerő hellyel rendelkeznek, és amelyeken ilyen DNS szekvenciákat meghatározó módon, a DNS esszenciális biológiai funkciójának elvesztése nélkül - pl. replikáció, burkoló fehérjék termelése vagy promoter vagy kötő oldalak elvesztése nélkül — elvághatunk, és amelyek a transzformált sejtek -azonosítására, pl. tetraciklin vagy ampicfllin rezisztenda kimutatására, alkalmas jelzést tartalmaznak. A klón-hordozót gyakran vektornak nevezzük. Klón-képzés Olyan módszer, amelyben aszexuális reprodukdóval szervezetekből vagy DNS szekvenciából szervezet-populádókat vagy DNS szekvendákat kapunk. Rekombináns DNS molekula vagy hibrid DNS Különböző genomokból származó DNS szegmensekből felépülő molekukák, amelyek az élő sejt külső részén vég — a véghez kapcsolattal rögzítődnek. s 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
