194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 tákban (pl. fibroplaszt Interferon). Nem a jelen találmány szerinti megoldás az sem, amelyet kutatási tervként javasoltak, tiszta vagy lényegében tiszta HuIFN-a mRNS előállítására HuIFN-a-gén kiónná alakítását megelőzően. Végül tisztában kell lennünk azzal, hogy poli(A)-RNS-bőI származó, oocitákban HuIFN-t előállító mRNS-hez hibridizáló rekombináns DNS molekula szekvenciájának megválasztása vagy a rekombináns DNS felépítése nem elegendő annak meghatározására, hogy a DNS szekvencia vagy a rekombináns DNS molekula hibrid inszertje megfelel HulFN-nek. Igazolnunk kell, hogy a HulFN-nek megfeleő DNS szekvencia vagy rekombináns DNS molekula valóban immunológiailag vagy biológiailag hatásos HulFN polipeptidet termel. Továbbá a találmány szerint csak miután igazoltuk a HulFN hatást, válik lehetségessé, hogy az annak megfelelő DNS szekvenciát vagy rekombináns DNS molekulát vagy szekvenciát más — HulFN-nek megfelelő — szekvenciák kiválasztására alkalmazzuk. Fentiekből következik, hogy a rekombináns DNS technikával történő HuíFN-a előállításának problémája számottevően különbözik a fent ismertetett eljárásoktól. Ez esetben ugyanis egy ismeretlen szerkezet sajátságos DNS szekvenciáját kell megállapítanunk — amely a megfelelő gazdaszervezetben a HuIFN-a termelését kódolja - és a DNS szekvenciák meglehetősen komplex keverékéből kell elkülönítenünk abból a célból, hogy HuIFN-a előállítására felhasználhassuk. Ráadásul a szekvenciamegállapítást és elkülönítést tovább nehezíti a komplex keverékben lévő kívánt DNS szekvencia várhatóan igen alacsony koncentrációja, valamint a sokfajta DNS szekvencia gyors analízisére alkalmas módszer hiánya. A találmány egy megfelelő gazdaszervezetben HulFN-a termelést kódoló DNS szekvenciák megállapítására és elkülönítésére vonatkozik. Dy módon a találmány tárgyát DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és azok az eljárások képezik, amelyek egy gazdaszervezetet humán leukocita interferon biológiai és immunológiai hatásával rendelkező polipeptid termelésére transzformáinak. A találmány szerinti módon vírus-, tumor- vagy rákellenes szerként használható, HuIFN-a immunológiai és biológiai hatásával rendelkező polipeptidet (polípeptideket) kapunk. E polipeptideket eddig nem ismert módszerekkel és olyan mennyiségben, mely korábban nem állt rendelkezésre, állítjuk elő. A találmány tárgyát képező DNS szekvenciák és rekombináns DNS molekulák HulFN-a immunológiai és biológiai hatásával rendelkező polipeptid megfelelő gazdaszervezetben történő termelésére alkalmasak. E DNS szekvenciák és rekombináns DNS molekulák megfelelő gazdaszervezetben történő replikációja a fenti polipeptideket kódoló gének nagyobb mennyiségű termelését teszik lehetővé. A szóbanforgó polipeptidek és gének tulajdonságait és molekuláris szerkezetét könnyen meghatározhatjuk. A géneket és polipeptideket vagy keletkezésük alakjában vagy megfelelő deriválássá vagy módosítással kompozíciókban használhatjuk, továbbá alkalmasak előállításuk megjavítására és kimutatásukra megfelelő módszerek kidolgozására, valamint vírus-, tumoréi rákellenes ágensként, illetve ilyen alkalmazásnál használható módszerek megismerésére. Ezek alapján a találmány tárgyát képező eljárást — mely legalább egy HuIFN-a immunológiai és biológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet kódoló megfelelő DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS és DNS szekvencia kiválasztását és előállítását öleli fel - élesen meg kell különböztetnünk a fend, korábbi eljárásoktól. A találmány alapaspektusát az a DNS szekvencia képezi, mely HulFN immunológiai vagy biológiai hatásával rendelkező polipeptidet kódol. DNS szekvencia-forrásként az alábbiakat vesszük figyelembe: Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4C, Z-pBR344 (Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322 (Pst)/HclF-SN35, Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287 (Pst)/HcIF-2h-AH6 DNS inszerteket, az előzőek bármelyikével hibridizált szekvenciákat, természetes, szintetikus vagy félszintetikus szekvencia-forrásokat, egyszeres vagy többszörös mutációval, bázis szubsztitúcióval, részletek kiiktatásával, a fenti szekvenciák vagy inszertek bármelyikének inszertálásával vagy inverziójával kapott DNS szekvenciákat, és olyan DNS szekvenciákat, amelyek kodonok olyan szekvenciáit tartalmazzák, amelyek kifejeződésekor hasonló immunológiai vagy biológiai aktivitást mutató polipeptideket kódolnak, mint az előző DNS szekvenciák és inszertek bármelyikének kodonjai kódolnak kifejeződéskor, ezek a szekvenciák lehetővé teszik az interferon és interferon-szerű polipeptidek termelését gazdaszervezetek ben. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: Olyan rekombináns DNS molekulák keverékének előállítási eljárásvázlata, melyek valamelyike a találmány szerinti polipeptideket kódoló inszert DNS szekvenciákat tartalmazza. 2. ábra A találmány szerinti első klón-szkrinelésl technikát szemlélteti. 3. ábra: A feltüntetett klón-szkrinelés technikában a találmány szerinti DNS szekvenciákat használjuk 4. ábra Egy találmány szerinti klón restrikciós térképét szemlélteti, a restrikciós oldalak abszolút helyzetét nem tünteti fel (ezeket a 8—10. ábra szemlélteti). 5. ábra Találmány szerinti rekóhibináns DNS molekulában egy DNS inszert orientációjának meghatározását ábrázolja. 6. ábra Néhány találmány szerinti klón-hordozó részleges nukleotid szekvenciáját ismerteti. 7. ábra Találmány szerinti baktérium kultúra felülúszójából Sephadex G-100-on kapott frakcionálás eredményét tünteti fel. 8-10. ábra Találmány szerinti rekombináns DNS molekula egy inszertjének DNS szekvenciáján ismerteti. A szekvencia-számozás az 5 poliG-véget követő nukleotidból a pollA és 3 poliC vég előtti nukleotidig tart. Az 57-125 nukleotldok egy szignál szekvenciát rejprezentálnak, míg a 126—626 nukleotldok az „érett interferon-kódot és stop-kódot tartalmazzák, A szignál szekvencia aminosav sorrendje a fenti (nukleotid szekvenciáját kis betűkkel írtuk le). Az Az ábra e génben lévő különböző restrikciós endonukleáz felismerési helyek abszo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
