194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
t 194 305 2 Hif-2h fragmenssel (1. fent) történő in situ telep hibridizációval [D. Hanahan és M. Meselson, Genc, 10, 63 -67 o. (1980)] szkrineljük és a plazmid DNS-t - Z-pBR322(Pst)/HchrlF-35HB „HchrIF-35HB”-t - a pozitív kiónokból elkülönítjük [N. M. Wilkie et al., Nucleic Acids Res., 7, 859-77 o. (1970)] (B. módszer). A hibrid inszert (HchrlF-35HB fragmens) pBR322 /3-laktamáz génhez viszonyított plazmidon belüli helyzetét EcoRI-gyel végzett hasítással kapott fragmensek osztályozásával határozzuk meg. A jflaktamázzal egybeeső orientációjú inszertet a-val az ellentétes orientációjút /3-val jelöljük. F pozitív kiónok kultúráit látszólagos OD650 = 0,8 értékig tenyésztjük, és a baktériumokat összegyűjtjük, majd S. Nagata et al. módszerével 0- fent) Dizozimes kezelés-fagyasztás-olvasztás módszerrel lizáljuk. A vizsgált tíz klón közül hét g-sejtenként 75 500 egységnyi IFN-a aktivitást mutat (a citopatikus hatás csökkentése alapján). E 7 IFN-t termelő klón egyikének DNS inszertjét E. coli HB101 (Z pBR322(Pst)/HchrIF-35HBa)- restrikciós analízissel és nukleotid szekvenciájának megli a tározásával részletesebben jellemezzük. A plazmid DNS-t (HchrlF-35HBetrt) a klónból az előzőekben ismertetett módon állítjuk elő, és a restrikciós helyeket Smith-Biinstiel módszerével [H. O. Smith and M. L. Birnstiel, Nucl. Acids Res., 3, 2387-98. o. (1967)] határozzuk meg, a következőképpen. HchrIF-35HBcrt (EcoRI-gyel emésztünk, 5 végén jelezzük, Bglll-vel emésztjük (és Pstl-gyel, a kb. 1 kb-s nem kívánatos fragmens hasítása céljából). Az 1,04 kb-s EcoRI-BglII (3 proximális) és 0,96 kb-os EcoRI-BgllI (5 proximális) fragmenseket agaróz gélen végzett elektroforézissel, A. C. Peacock és C. W. Dingrnan módszerével [Biochemistry, 6, 1818-27. o. (1967)] különítjük el. Mindkét fragmenst Hinfl-gyel, Bspl-gyel ül. Mboli-vel részlegesen hasítjuk, és a termékeket 1%-os agaróz] gélen, 1 jug/rnl etidum-bromidot tartalmazó Trisz-acctát pufferben (pH = 7,8) különítjük el. Megfestés után a radioaktív sávokat autoradiográfíával tesszük láthatóvá. A BstNI és HgiAI helyeket az 1,04 kb-s (3 proximális) fragmensben hasonlóképpen határozzuk meg. Az analízis eredményeit a 19. ábrán mutatjuk be. A nukleotid szekvencia meghatározása céljából HcgrlF-35HB(M különböző restrikciós enzimekkel hasítjuk, a termékeket 5%-os poliakrilamid gélen Trisz-borát EDTA pufferben (A. C. Peacock, C. W. Dingrnan — fenti közleményük) végzett elektroforézissel különítjük el és a gélről történő extrahálást és tisztítást W. Muller et ai. módszere szerint végezzük [3. Mól. Bioi, 124, 343-58 (1978>. Az alkalmazott szekvenciálási stratégiánkat a 19. ábrán mutatjuk be, és a következőképp jellemezzük: 1 és 2 - HchrlF 35HBa-t Bglll-vel hasítjuk, jelezzük, hasítjuk EcoRI-gyel és Pstl-gyel, a Bg]ll*-Eco- RI fragmenst (940 b.p.) (1) és a BglIl*-EcoRI fragmenst (360 b.p) (2) elkülönítjük. 3 és 4 - a HchrIF-35HBad EcoRI-gyel hasítjuk, jelezzük, Bspí-gyel hasítjuk, és az EcoRI*-BspI fragmenst (680 b.p.) (3) és az EcoRI*-BspI fragmenst (880 b.p.) (4) elkülönítjük, 5, 6, 7 és 8 - HchrIF-35HBcu PvuII-vel hasítjuk, jelezzük, Bglll-vel és EcoRI-gyel hasítjuk, és a Pvull'-EcoRI fragmenst (780 b.p.) (5), a PvuII*BglII fragmenst (215 b.p]) (6) a PvulI*-BglII fragmenst, (90 b.p.) (7) és a PvuII*-EcoRI fragmenst (290 b.p.) (8) elkülönítjük. 9 és 10 -HchrIF 35HBoa EcoRI-gyel hasítjuk, 1%-os agaróz gélen Trisz-borát-EDTA pufferben elektroforizálva egy 1300 b.p.-ből álló EcoRI-Eco- RI fragmenst elkülönítünk, Hlnfl-gyel tovább hasítjuk, a lUnfl-IIinfl fragmenst (450 b.p.) és a Hinfl-Hinff (180 b.p.) fragmenst elkülönítjük. A nagyobb Hinfl-HinfI fragmens jelzésével és MboII-vel végzett hasításával a Hinfl* MboII fragmenst (190 b.p.) (9) különítjük el. A rövidebb Hinfl-Hinfl fragmens jelzésével és Avall-vel végzett hasításával egy Hinfl*-Avall fragmenst (150 b.p.) (10) különítjük el, 11 - HchrIF-35HBad Bspl-gyei és Bglll-vel hasítjuk, az 1200 BspI-BglII fragmenst agaró/.on végzett elektrofézissel különítjül el és vagy a) HgiAI-gyel, jelzés után pedig MboII-vel hasítjuk, majd a HgiAI*-MboII fragmenst (300 b.p.) (12) és a HgiAI'-MboII fragmenst (360 b.p.) (13) elkülönítjük, vagy b) BstNI-gyel, jelzés után pedig EcoRI-gyel hasítjuk, és a BstNl*-EcoRI fragmenst (380 b.p.) (14) elkülönítjük. A különböző fragmenseket Maxam-Gilbert módszerével (melyet a fentiekben ismertettünk) szekventáljuk. Valamennyi fragmenst a restrikciós helyeken keresztül — melyek a szekventálás kiindulópontjaiként szolgálnak — mindkét szálon szekventáljuk. A HchrlF-35HBa és Hif-2h kódoló területeinek nukleotid szekvenciáját összehasonlítva (melyet a 8 - 10. és 20-23. ábrák összehasonlításával szemléltetünk), megállapíthatjuk, hogy azonosak. Meglepő módon, a HehrIF-35HBa fragmens kódoló szekvenciáján belül - azaz az 5’ nem-kódoló régió Hinfl helye és a 3 nem kódoló régió EcoRI helye között - intionok jelenlétére utaló jelzés nem figyelhető meg. Tehát, az érett IFN-amRNS-nek megfelelő kromoszómális szekvenciában intront nem lehet kimutatni. Hif-chr 26 és Hif-chr3 további jellemzése A chr-3 és chr-26 gént tartalmazó szegmenseit — melyek heteroduplex analízis alapján azonosnak látszanak, de legalább egy BglII restrikciós hely tekintetében különbözőek — nukleoóü szekventálással vizsgáljuk. A 725 bázis páron belül öt nukleotid különbözősége mutatható ki. A kódoló szekvenciában ezek közül csak kettő található. Mjven nemcsak a gének, hanem legalább 3,5 Kbp. megelőző és 6,0 Kbp követő szakasz alkotnak egy tökéletes heteroduplexet, továbbá a viszonylag kismértékű szekvencia eltérés csak két aminosavban való eltérést eredményez, nyilvánvalóan a Hjf-chr3 és Hif-chr26 ugyanazon gén allelikus fonnál. Ezeket IFN-a4a-val (Hif-chr) és IFN-adb-vel (Hif-chr26) jelöljük. Az IFN-ű4b nukleotid szekvenciáját és a megfelelő aminosav szekvenciát az előzőekben Ismertetett szekven tálási módszerekkel határozzuk meg, a 29-32. ábrákon bemutatott módon. ' A 29-32. ábrákat a 8-10., 12-16, és 20 2X ábrákkal összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy mindegyik szekvencia által kódolt fehérjék egymástól részeiknek kb. 15% ában különböznek. Ez az eltérés 20-90 millió évvel ezelőtt különbözővé váló nem-allelikus gének termékeire jellemző. A Hif-chr35 expressziója egér sejtekben A fenti Z-pBR322 (Pst)/HchrIF 35HBa plazmldot Hif-cbr35 fragmens egér sejtekben történő expressziós forrásaként használjuk. A plazmldot Pstl-gyel hasít; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 29
