194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 juk és az 5 dG farokrészek eltávolítása céljából 5 exonukleázzal kezeljük. E fragmenst pollnóma DNS és pBR322 BamlíI-BamHI fragmenseínek összekapcsolásával előállított plazmid 5 dG-farokrésszel ellátott KpnI fragmensébe inszertáljuk. A kafiott vektorral, kálcium-foszfátos módszert használva N. Mante! et al., Nature 281, 40-46 o. (1979)], 3T2 egérsejteket transzformálunk. E transzformált sejteket kényelmi okokból 3T3 Egér (polinoma-Hif-ehr35) szimbólummal jelöljük. 20—40 óra múlva végzett vizsgálatok alapján humán sejtek esetén 300 egység/ml-nyi, szarvasmarha sejtek esetén kb. 3000 egység/ml-nyi IFN-a aktivitást kapunk. Nyilvánvalóan a 8—10., 12—16., 20-23. és 29-32. ábrákon feltüntetett nukleotid szekvenciákon a már esetleg végbement, vagy későbbiekben lejátszódó, a nukleotid szekvenciákat érintő változásokat, pl. egyszeres vagy többszörös mutációt, bázis szubsztitúciókat, inszertálásokat, inverziókat vagy kivágásokat nem veszünk figyelembe. Ráadásul a szekvenciában nem vesszük figyelembe az ezen ábrákon feltüntetett kodonnak ugyanazt az aminosavat kódoló más kodonokkal lehetséges szubsztitúcióját. így e módosított szekvenciák — melyek az IFN-a immunológiai vagy biológiai hatásával rendelkező polipeptideket kódolnak — szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A 8 -10., 12-16., 20-23. és 29-32. ábrákon feltüntetett aminosav szekvenciák esetén a polipeptidek in vivo, p. az in vivő glikozálásban szereplő enzimekkel, vagy in vitro ágensekkel való kölcsönhatásának eredményeként létrejövő változásokat sem vesszük tekintetbe. Azonban e polipeptidek ilyen fragmensei és származékai — melyek az IFN-a immunológiai vagy biológiai hatásával rendelkeznek — szintén a találmány tárgyát képezik. Az interferon immunológiai vagy biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidek bakteriális gazdaszervezetekben történő előállítása Mivel a citopatikus hatás csökkentése alapján [W. E. Stewart II és S. E. Sulkin S. E. Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 123, 650-53 o. (1966)] az IFN egészen kicsiny mennyiségeit ki tudjuk mutatni — kevesebbet mint egy aktív molekula/bakteriális sejt — tíz hibrid A fággal a fenti módon fertőzött E. coli HB101 lizátumokat az IFN jelenlétének kimutatása céljából vizsgáljuk. A 11 fág közül 7 (a chr-10-t, chr-12-t, chr!9-t és chr27-t kivéve) ml-ként 3-50 egység IFN aktivitást tartalmazó lizátumokat eredményeznek. Chr-10 és chr-12 esetén a (Hif-2h-val) hibridzáló HindlII-HindlII vagy EcoRI-EcoRI fragmensek pBR322 PstI helyére a fenti módon szubklónozva — E. coliban IFN-a aktivitást eredményeznek. Mivel az E. coli mRNS összekapcsolására alkalmatlan (O. Mercereau-Puijalon, P. Kourilsky, Nature, 279, 64749. (1979)), e IFN-a kromoszómális gének a kódoló részben valószínűleg intronokat nem tartalmaznak. Következtetések Sendai vírussal kezelt (indukált) humán leukociták poli(A)RNS-éből előállított cDNS- tartalmazó rekombináns molekulák oly sorozatát különítjük el, amelyek a következő sajátságokkal jellemezhetők: (1) Indukált humán leukocita pli(A)RNS-sel hibridizálnak, míg nem indukált humán leukocita pli(AÁ -RNS-sel nem, (2) IFN-am RNS-sel hibridizálnak, amelyet azzal a tulajdonságukkal jellemzünk, hogy RNS-ek keverékéből az előbbi RNS-t választják ki, valamint azzal, hogy a gátolt-hibrid lefordítási tesztben az interferon-mRNS lefordítását reverzibilisen gátolják, (3) A sorozat bizonyos tagjait tartalmazó E. coli az alábbi tulajdonságú vegyületet termeli: a) tripszinre érzékeny, b) humán sejtrendszerben IFN-a aktivitással rendelkezik, míg egér sejtrendszerben csak csekély aktivitást mutat, c) 20 000 és 30 000 közötti molekulasúlyú (a 8-10 ábrán bemutatott nukleotid szekvencia alapján molekulasúlya 19 388). d) IFN-a aktivitását humán leukocta interferonra antitest tulajdonságú anyag specifikusan gátolja, (4) A találmány ./.érinti hibrid plazmidok DNS inszertjei RNS-ek keverékéből az IFN-amRNS-t, különböző forrású — beleértve a cDNS-eket is — keverékekből, valamint kromoszomális DNS hibrid fág gén-bankjaiból az IFN-aDNS-t képesek kiválasztani, (5) Több különböző, az IFN-aért felelős kromoszómális gén létezik. Meglepő, hogy e génekben intronok nem fordulnak elő, és hogy megfelelő gazdaszervezetekben az interferon és interferon-szi.. a polipeptidek közvetlen expressziója lehetséges, (6) E rekombináns DNS molekulák DNS inszertjeinek legalább három nukleotid szekvenciája különböző, mely azt valószínűsíti, hogy legalább három, az IFN-anak megfelelő nem-allelikus gén létezik, (7) E három nukleotid szekvencia által kódolt fehérjék az autentikus limfoblasztoid interferonból meghatározott 35 aminosavban különböznek, (8) Az IFN-a gén szegmensek különböző kombinációival előállított hibrid fehérjék egymástól vagy szüleiktől kvantitatíve különböznek, és vagy az IFN-a val összekapcsolt további aminosavakat tartalmaznak vagy arrúno terminális szekvenciájuk vagy része nélkül, az IFN-a aktivitásával rendelkezve, az IFN at tartalmazzák. E tulajdonságok arra utalnak, hogy a találmány szerinti rekonbináns DNS molekulák a humán leukocita interferont kódoló szekvenciát legalábbis részben tartalmazzák, továbbá, hogy néhány ilyen plazmid E. coliban a humán leukocita interferon immunológiai vagy biológiai aktivitásával 'rendelkező polipeptidet expresszálnak. A találmány szerinti polipeptideket az oltalmi körön belül, a fehérje-kémiában jól ismert módon fragmentáljuk, módosítjuk vagy deriváljuk. A találmány szerinti eljárással előállított mikroorganizmusokra és rekombináns DNS molekulákra példaként — HcIF-A-E jelölésekkel szimbolizált alábbi kultúrákat helyeztük letétbe Göttingenben (NSZK) a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen kultúra gyűjteményben, 1980. január 7-én: A: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF4c) B: E coll HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h) C: E. coli HB101 (Z-pBR322(Psti)/HcIF-SN35) D: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42) E: E. coli HB101 (Z-pKT287/Pst)/HcIF-2h-AH6) E kultúrák azonosítási száma — a fentieknek megfelelően DSM 1699-1703. A találmány szerinti eljárással előállított mikroorganizmusokra és rekombináns DNS molekulákra további példaként — HcIF-G-H jelölésekkel szimbolizált, 31633 ill. 31634 ATCC azonosítási számú -5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 30
