194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 nyíljuk, és centrifugálással hasítjuk. Az aktivitás értékeket humán, egér, tengerimalac és szarvasmarha sejteken határoztuk meg: Fehéije forrás Humán Relatív IFN aktivitás (FS4) Szarvas- Egér Tengeri * marha (L) malac C8-1FN a2 1 1 0,01 0,03 C8-IFN-al 0,03 1 0,3 0,03 Hibrid 1 0,001 1 0,003-0,008 0,003-0,01 Hibrid 11 0,001 1 0,001 0,01 Hibrid III 1 1 1 0,3 Hibrid IV 0,1 1 2 0,1-0,005 Negatív kontrollMeglepetésünkre valamennyi interferon fajta szarvasmarha sejteken kb. ugyanolyan hatásos, míg az IFN-al és a I, II, IFN hibrid, melyek az IFN-al amino-terminális részét tartalmazzák, kb. 10-1000- szer kevésbé hatásosak humán sejteken, mint az IFN-a2 és az IFN-a2 amino terminális részét tartalmazó III és IV hibrid molekulák, továbbá az IFN-al arnino terminális részét tartalmazó I és II hibridek több mint tízszer kevésbé hatásosak humán sejteken, mint maga az IFN-al. Sőt, a III hibrid - az IFN-a2 amino terminális részét tartalmazza — humán sejteken kb. azonos aktivitású az IFN-a2-vel. Az IFN-akromoszómális génjeinek azonosítása Humán magzati kromoszómális DNS fragmensekből - melyeket HaelII-mal és Alul-gyel végzett parciális hasítással és EcoRI-gyel A Charon 4A ágakhoz történő kapcsolással készítünk — szánnazó hibrid fág készletet R. M. Lawn et al. [Cell, 15, 1157—74. o. (1978)j módszerével állítunk elő. E gén-bankot In situ módszerrel [W. D. Benton és R. W. Davis Science 196, 180-82. o. (1977), T. Maniatis et al, Cell, 15, 68-701 o. (1978)] tesztanyagként pBR322 (Pst/Hif-2h-ból kivágott 3 7 P-vel jelzett IFN-al cDNS inszertet használva szkrineljük. Ismételt pakk tisztítási módszerrel (T. Maniatis et al. fenti közleményük), 240 000 plakk közül 16, hibridizáció tekintetében pozitív, fág kiónt különítünk el. Tíz hibrid fág DNS preparátumot HindlII-tnal, Tacl-gyel, Hhalgyel, Bamlil gyei, EcoRI-gyel és Bglll-rnal hasítunk külön-külön és a fragmenseket agaróz gélen elektroforézissel különítjük el, majd Millipore membránra visszük [E. M. Southern, J. Mól. Bioi., 98, 503- 17 o. (1975)] és S1 P-vel jelzett Hif-2h cDNS inszerttel hibridizáljuk. A 18. ábrán részleges restrikciós térképek és különböző táblázatok alakjában foglaljuk össze az eredményeket. Amint az ábrából kitűnik, valamennyi hibrid fág DNS esetében legalább néhány jellemző restrikciós helyet meghatározunk és az IFN-al gén mintával hibridizáló részt (részeket) ábrázoljuk (fekete nyíllá] jelöljük)*. *A 18. és 24. ábrákon a chr-16-on besatirozott területtel a Hif-2h-val gyengén hibridizáló, de R-hurkolást nem mutató, szekvenciát jelezzük. A 18. és 24. ábrákon a chr-3 és chr-26 kiónok olyan DNS szegmenseket képviselhetnek, melyek — mivel általában néhány EcoRI és HindlII fragmenssel rendelkeznek — hosszúságuk nagy részét átlapolnak. Továbbá, a chr-1 hibridizáció része és a chr-10 egyik hibridizáló része lehetséges, hogy azonos, mivel a Hindlll-Hindlll és EcoRI-EcoRI fragmensek, melyek a Hlf-2h mintával hibridizálnak, azonos hoszszúságúak (3,2 kJ), ül. 0,95 kb.). Kitűnik, hogy a chr-16 .jobbra eső’ hibridizáció része (melyet a 18. ábrán r-re3 jelölünk), a chr-35 hibridizáció részével azonos lehet, bár ez ellentétes orientációjú, amennyiben a két klón egy 1,4 kb BgllI-BgJII fragmenst és egy 2 kb. EcoRI-EcoRI fragmenst termel, melyek Füf-2h cDNS tesztanyaggal hibridizálnak. így nagyon valószínű, hogy a chr-16 és chr-35 inszertek átlapolnak- __ Ennek megfelelően a 11 hibrid kromoszómális DNS 13 hibridizáció része nem kevesebb, mint 10 különböző osztályba sorolható, nevezetesen: chr-1, chr-3, chr-12, chr-13, chr-16 (bal oldalt, a 18. ábrán 1-gyel jelöljük), chr-26, chr-30, chr-35, chr-19 és chr-27. A 24. ábrán chr-1, chr-3, chr-10 és chr-26 és chr-16, chr-35 átlapolását ábrázoljuk. A fenti adatok azt valószínűsítik, hogy egy Individuális humán genom nem kevesebb, mint 10 különböző. Hif-2h-val hibridizáló DNS szekvenciát tartalmaz. E következtetésünket megerősíti az a tény, hogy a klón-bankban kimutatott, IBf-2h-nak megfelelő fragmens aránya kb. 1/16 000. A haploid humán gén esetén 3xl09 b.p. értékkel számolva, 16 kb.-jú átlagos DNS fragmens méret esetén (a vizsgált kiónok átlagos értéke) az egyszeres gén másolat értékeként kb. 1/190 000-t várunk. így a Hif-2h-nak megfelelő fragmensek gyakorisága 12-szer nagyobb, mint amekkora egy egyszeres gén esetén várható volna. Ha összehasonlítjuk ezeket az adatokat Lawn et al. (fenti közleményük) adataival, akik ugyanebből a gén bankból származó 300 000 plakkot /í-globin cDNS tesztanyaggal szkrinelve csak két pozitív kiónt azonosítottak, akkor a várt érték 1,6/300 000. így a humán genomban 10-15 különböző kromoszómális DNS szegmens lehet, melyek a Hif-2h fraginenssel vagy IFN-al cDNS-sel kereszt-hibridizálnak. A Hif-chr35 további jellemzése Jellemzésképpen chr-35 hibridizáló szekvenciáját (hif-chr 35) részletesebben újuk le. Az előzőekben leírt kromoszómális hibrid fágok hibridizáló részét hasonlóképpen jellemezhetjük, az oltalmi körön belül maradva. A chr-35 hibridizáció része (Hif-chr35) (és a Hif-chr 16 jobb oldali szegmense, amellyel nagy valószínűséggel azonos — lásd fentiekben) az egyedüli, BglII-vel rendelkező, hibridizáló kromoszómális DNS rész. Mivel az IFN-al és IFNa2 cDNS-ek kódoló szekvenciájukon belül 1 ül. 2 BglII hellyel rendelkeznek, valószínűnek látszik, hogy a Hif-chr35 az előző két klónozott interferon egyikének párja. A Hif-chr-35 Hif-2h cDNS fragmens 3 terminálisával (csak 3 nem-kódoló részt tartalmaz) való erős hibridizációja, összehasonlítva más kromoszómális DNS e mintával való gyengébb hibridizációja, megerősíti, hogy valószínűleg a Hif-chr35 és Hif-2h között megfelelés ügyelhető meg [F. Kafatos et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 74, 5618-22 o. (1977)]. Hif-chr35 fragmens további analízise céljából chr-35-ből egy HindIH-BamHI fragmenst hasítunk ki. E fragmens (3,4 kb.) tartalmazza a chr-35 hibridizáló részét (hid-chr35). E fragmenst pBR322 PstI helyére szubklónozzuk, a jól ismert dC-dG farok kapcsolási módszerekkel (L. Villa-Komaroff et al. — fenti közleményük), és a kapott rekombináns DNS molekulával, Ismert módon [pl. S. Nagata et al. Nature, 284, 316-20 o. (1980)] E. coli HBlOl-t transzformálunk. E transzformált egyedek kiónjait *5 P-vel jelzett 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 28
