194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 ba történő inszertálása után kapott plazmjdot Hind-Ill-mal és EcoRI-gyel hasítjuk, a LAC promoter 1FN-02 génhez való közelebb kerülése céljából SÍ nukleázzal kezeljük, majd újraligáljuk. E LAC-AUG{a2) plazmid IFN-a2 szekvenciája a LAC promoter Irányítása alatt áll. Továbbá a promoter inlciáló AUG kodonját az IFN-a2 szekvencia követi közvetlenül (1. 27. ábra). Így az ezek a plazmldok által termelt IFN-nek legalább egy része érett 1FN, pl. a szignál szekvenciából származó bármilyen aminosav nélküli IFN. A LAC-AUG(ct2) plazmiddal a minisejtekben előállított IFN-a mennyisége 5-10 millió egység literenként. Hasonló kapcsolási elvek felhasználásával egy további lFN-o2 szerkezetet állítunk elő. Ez esetben pBR322 penicillináz expressziót szabályozó szekvenciáját AUG iniciátor kodonon keresztül Hif-II-206 ÍFN-02 génjéhez kötjük*. E /Tlac-AUG(a2) jelzésű plazmiddal transzformált gazdasejtek egy fehérje szekvenciához nem kapcsolódó IFN-a2-t termelnek a minisejtekben literenként 50-100 millió egység terméket kapunk. E plazmid a találmány szerinti legkedvezőbb plazmid. Előnyösen használhatjuk más találmány szerinti génnel is. A találmány szerinti előnyös gazdaszervezet az E. coli DS410 törzs fara azide TonA lac y Tsx min a min b gal X xyl step**). E törzset az előnyös /Tlac-AUG(©2) plazmid egy példányával együtt HclF-k néven helyeztük letétbe. *E szerkezetet leghatásosabban pBR322 MboII-vel történő részleges emésztésével, SÍ-gyei való kezeléssel, EcoRI kapcsolókkal a fenti módon, majd a fragnes pBR322 EcoRI helyéről történő újrainszertálásával és egy EcoRI hely törlésével állíthatjuk elő. Ezután a kapott jílac-AUG plazmjdot a fentiekben ismertetett 206 jelzésű SÍ gyei kezelt (enyhe) Hindii! kapcsolt Bspl fragmenssel kombináljuk. EcoRI gyei történő hasítás és SÍ gyei, valamint foszfatázzal való kezelés után a plac-AUG(a2) expressziós plazmidot elkülönítjük, Más génekkel hasonló módon, csupán vagy a jílac-AUG plazmidot más gének vagy szerkezetek inszeitálasára használva, vagy előnyösebben a ß1ac-AUG(a2) plazmidban Sau3A helyett használva egyéb szerkezeteket készíthetünk. A fenti módszerekkel és elvek alapján, különböző promoter szekvenciákat, riboszóma kötőhelyeket, Shine-Dalgamo szekvenciákat és a promoter és az AUG inicláló kodon közötti DNS szekvenciákat, valamint a találmány szerinti különböző IFN-a géneket használva, más egyéb szerkezeteket is létrehozhatunk, melyek a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az IFN-al és IFN-o2 hibrid molekulái Az IFN-al és IFN-a2 néhány hibrid molekuláját előállítva, meglepetésünkre kvantitative különböznek sajátságaik és aktivitásuk tekintetében szüleiktől, azaz az IFN-al-tői vagy az IFN-a2-től. A 28. ábrán négy üyen hibrid molekula felépítésének sematikus vázlatát mutatjuk be. Kényelmi okokból e hibrid molekukálat I, II, III és IV plazmidnak nevezzük. E molekulákban a restrikciós enzimekkel (melyeket a Biolabs-től szereztünk be, a Bspl kivétem lével, mely Dr. Kiss ajándéka) végzett emésztést lényegében a szállítók által ajánlott módon végezzük. Részleges DNS hasítást csökkentett mennyiségű enzimmel valósítunk meg. A restrikciós enzim 65°C hőmérsékleten 30 percen át tartó kezeléssel végzett inaktivitása után a mintákat 50 mmólosra állítjuk be Trisz-HCl-re (ph = 8) és amennyiben szükséges, borjúbél alkálikus foszfatázt (Bohringet) adunk hozzá Otg DNS-enként 1 térfogatrészt). Ezután 30 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, majd fenollal és éterrel extraháljuk. A legtöbb esetben a DNS fragmenseket alacsony hőmérsékletű agaróz gélen (0,8%), különítjük el. Ligálás céljából a gél darabokat (mindegyik kb. 20 fi) tartalmazó fragmenst 65°C hőmérsékleten megolvasztjuk, 37°C-ra hűtjük és /i-enként 20 egység T4 DNS-ligázt adunk hozzá. Az elegyet 15°C hőmérsékleten 16 órán át tartjuk és a ligálás a megszilárdult gélben megy végbe A keveréket tizedrész 100 mmól/liter Trisz-HO (pH = 7,5), 100 mmól/liter CaCl2-t és 100 mmól/liter MgCl^-t tartalmazó oldat hozzáadása után 5 percig 65°C hőmérsékleten tartjuk, unajd 37°C hőmérsékletre hűtjük. A mintákat Ca -nak kezelt minisejtekhez adjuk, 0°C-on 20 percen át^ inkubáljuk, 1 percig 42c on és 10 percen át 20°C hőmérsékleten tartjuk, majd 1 ml tripton táptalajt adunk hozzá. 60 percen át tartó 37°C-on végzett inkubálás után, a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó agar lemezekre rétegezzük. Valamennyi plazmidot nukleotid szekvencia analízissel jellemezzük, az IFN szekvencia kapcsolási pontján. A I hibrid molekulát - mely al (PvuII)Æ2hibrid, CB-IFN-al (1 fent) (28. ábrán C9-al) PvuII- vel végzett részleges hasításával, defoszforilezéssel, Pstl történő hasítással, a PstI-PvuII(P2) 1346. b.p. fragmens elkülönítésével állítjuk elő. E fragmenst 2135 b.p. Pstl(a) PvuII(P2) fragmenssel ligáljuk, ez utóbbi pedig C8-IFN-02 (1. fent) (28. ábrán C8- -a2) PvuII-vel végzett teljes, és Pstl-gyel végzett részleges hasítással állítjuk elő. A II hibrid molekulát - mely a-l(BglII)a2 hibrid - a T hibrid molekula BglII-vel végzett hasításé val állítjuk elő. Defoszforilálást követően a nagy Bglll fragmenst elkülönítjük és a C8TFN-02 kicsiny BglII fragmensével ligáljuk. Klónozás után, a helyes pozícióban a kicsiny BglII fragmenst tartalmazó hibrid plazmidot restrikciós analízissel azonosítjuk. A III hibrid molekulát — mely a2(PvuII)Orl liibrid - C8-IFN-al PvuII-vel végzett részleges hasításával, defoszforilezéssel, Aval-gyel végzett hasítással, majd az 1686 b.p. PvuII(P2)-XvaI és 3233 b.p. PvulI(P2)-AvaI fragmensek elkülönítésével állítjuk elő. E fragmenseket HcIF-II-206 (1. fent) (28. ábrán SN206) 300 b.p. PvuII(Pj)-PvuII(P2) fragmensével ligáljuk, és a kicsiny Pvuíl fragmenst tartalmazó plazmidot a transzformált E. coli törzsek IFN-a aktivitásának vizsgálata alapján azonosítjuk. A IV hibrid molekulát — mely Or2(BglH)arl hibrid - C8-IFN-al BglII-vel és Aval-gyel végzett hasítással és az 1776. b.p. fragmens elkülönítésével állítjuk elő. Ezután e fragmenst a III hibrid molekula 3543 b.p. BglII-Aval fragmensével ligáliuk. A különböző Tíiterferon fajták egymáshoz vlsző: nyitott biológiai aktivitását meghatározzuk. A különböző plazmidokkal transzformált E. coli DS410 mini sejt kultúrákat tenyésztjük, a baktériumokat centrifugálással elkülönítjük PBS-sel (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasó oldat) mossuk, PBS-ben (kb. az eredeti térfogat 1/20-ad részében) szuszpendáljuk, 60 percen át 0°C-on 1 mg/ml lizozimmel 10 mmólos EDTA-val inkubáljuk, négyszer fagyasztjuk és felolvasztjuk, ötször fecskendendőn átvezetve el-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27
