194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 185-ös pozícióban. A két Ínszert által kódolt aminosav-szekvenciát összehasonlítva kitűnik, hogy a Hif-II-206 fragmens által kódolt interferon-szerű fehérje eleggyel kevesebb aminosavat tartalmaz, mint a Hif-2h fragmens által kódolt (a Hif-2h esetén jelenlévő 44-es aminosav (Asp) a Hif-11-206 esetén hiányzik). Továbbá, a nukleotid pozíciók 10%-a és származtatott aminosav részek 17%-a különbözik a két fragmensben. A limfoblasztoid interferon amino-terminálisának 35 aminosav komponensét (melyet K. C. ZOON et al. határoztak meg) [Science, 207, 527-28. o. (1980)] összehasonlítva a Hif-II-206 inszert által kódolt fehérjével, megállapíthatjuk, hogy ez 5 aminosav részben különbözik a Zoon et al által meghatározott (fenti közleményük) 35 aminosav komponenstől. így legalább három különböző leukocita típusú (a-típusú) IFN gén kell, hogy létezzék, nevezetesen Hif-2h fragmens, Hif-II-206 fragmens és a Zoon-féle IFN-t kódoló gén. Az újonnan javasolt interferon nomenklatúra szerint, az ezen gének által kódolt fehérjéket a következő módon írjuk le: IFN-gén forrás Fehérje Hif-2h IFN-al Hif-II-206 IFN-e2 limfoblasztoid sejtekből származó IFN (Zoon et al. IFN-a3 - fenti közleményük) Az IFN-al és IFN-a2 közötti különbség humán CCL23 és szarvasmarha embrió vese (SZEV) sejtekre gyakorolt különböző hatásban is megnyilvánul: Extraktum: CCL23 Relatív IFN aktivitás* ** SZEV Arány Hif-II-206 ( (IFN-02) 1,7 1,0 1,7:1 Hif-SN35*# (IFN-al) 0,05 1,0 1 :20 *A hibrid plazmidot tartalmazó E. coli HB101-t tripton táptalajon tenyésztünk és kb. 1—2 OD650 értékig rázzuk. A sejteket összegyűjtjük, súlyukat megmérjük, majd az eredeti kultúra 1/100 vagy 1/20-ad részében újraszuszpendáljuk és lizozim-fagyasztás-olvasztás módszerrel lizáljuk. (S. Nagata et al., Nature, 284, 316-20 o. (1980)). Az S-30-as felülúszókat citopatikus hatás csökkentése alapján mlkrotiter lemezeken teszteljük. A kontroll sejtekből nyert extraktumok negatív eredményt adnak (< 1 N.E./ml). Humán CCL23 sejteket és szarvasmarha embrió vese (SzEV) sejteket (FLOW) MEM— -10% borjú magzati szérumrendszerben tenyésztünk és IFN-t tartalmazű extraktumokkal 24 órán át kezeljük. Ezután Mengo vírus megfelelő hígítását adjuk hozzá és 24 óra múlva megfestjük. Az értékeket ismert titerfl részlegesen tisztított leukodta IFN (PIF preparátum, K. Cantell ajándéka)-re vonatkoztatva vizuálisan becsüljük. E készítmény kb. háromszor aktívabb humán, mint szarvasmarha sejteken. **Hif-SN35 és Hif-2h restrikdós térképeinek összehasonlítása alapján megállapíthatjuk, hogy egyik a másik polimert változatának tekinthető (1. fentiekben). A fenti eredményekből kitűnik, hogy humán sejtekre gyakorolt hatás tekintetében az IFN-al kb. harmincszor kevésbé aktív, mint az IFN-CÛ. Mégis szarvasmarha sejteken mindkettő kb. azonos aktivitású, .Ezt figyelembe véve, az interferonokat vírusellenes, tumor- és rákellenes szerekként embereken való felhasználásukon kívül szarvasmarhák hasonló megbetegedéseiben is alkalmazhatjuk. Például a HuIFN-a készítményeket a szokásos módon (1. fentiekben) szarvasmarhák FMDV és más jól ismert vírus megbetegedéseinek terápiájában használhatjuk. Ez különösen az IFN-al-re vonatkozik, minthogy szarvasmarha sejtekre gyakorolt hatása kb. húszszor nagyobb mint humán sejtek esetén. Mivel az IFN-al esetén a C8 létrehozásával jobb hozamot érünk el (1. fentiekben), az IFN-02 esetén is hasonlóan járunk el. Z-pBR322(Pst)/Hif-II-20b-ot Bspl-gyel teljesen, PvuII-vel részlegesen (a Pl helyen) elhasítunk és a 867 b.p.-ból álló fragmenst 6%-os poliakrilamid gélen elkülönítjük. E fragmenst ezután C8-IFN-01* 2590 b.p.-ból álló PvuII fragmenshez Egáljuk. A kapott hibrid plazmiddal E. coli HB101-t transzformálunk és a kiónokat az IFN hatás szempontjából vizsgáljuk. A jelentős aktivitású kiónt elkülönítjük és E. coli HB101 (C8-IFN-a2) szimbólummal jelöljük. A C8-IFN-02 hibrid plazmid szekventálása arra utal, hogy a C8-IFN-al-hez hasonlóan, a 8-IFN-a2 az iniciátor triplettel követően olyan kódoló szekvenciával rendelkezik, amely meghatározza a /3-galaktozidáz első hét aminosav komponensét, az összekapcsolódással létrejövő Pro maradékot és az IFN-02 szignál-szekvencia 16-23 aminosav komponenseit. így valószínűleg egy IFN-a2-t tartalmazó összekapcsolt fehérje expressziálódik. * C8-IFN-al három PvuII restrikdós hellyel rendelkezik (28. ábra). A 2590 b.p.-jű fragmens és a P! és P3 helyek között helyezkedik el. A plazmiddal transzformált minisejtek Éterenként 100—200 millió egység IFN-t állítanak elő, vagy másképpen kifejezve 20 000-40 000-szer több IFN-a2-t, mint a módosítatlan Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206-tal transzformált minisejtek esetén. A C8-IFN-al (~50xl0Ä egység/liter) és C8-IFN-02 (~100-200 millió egység/liter) relatív hozamának összehasonlítása, elsőre meglepő számunkra, mivel humán sejteken az IFN-a2 kb. harmincszor aktívabb, mint az IFN al (1. fentiekben) Azonban a két C8 plazmiddal transzformált minisejtek által előállított két fehérje mennyiségi analízise am utal, hogy C8-IFN-al-ben kb. ötször-hatszor több fehérje termelődik, mint a C8-IFN-a2-ben. így az IFN aktivitás alapján mért hozamok félrevezetőek a C8- -IFN-al esetén kapott sokkal nagyobb mennyiségű fehérje miatt. A 26. ábrán az IFN-a2 hozamának növelésére vonatkozó újabb kísérletet szemléltetünk. Először LAC Alu fragmenset tartalmazó expressziós plazmidot állítunk elő oly módon, hogy az ismert lac promoter! Alul-gyel hasítjuk és a fragmenst a 27. ábrán bemutatott módon EcaRI kapcsolókkal növeljük. Ezután a kiterjesztett fragmenst pBR322 EcoRI helyére inszertáljuk, és egy kicsiny EcoRI-EcoRI fragmenst a szerkezetből eltávolítunk. A kapott olazmidot - melyet a 26. ábrán 404-gyel jelzünk - az IFN-a2-t tartalmazó fragmens inszertálása céljából HindlII-mal és PvuII-vel hasítjuk. Az IFN-a2 fragmenst Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 részleges Sau3A restrikciójával (a 26. ábrán 206 jelzésű), a Sau3A fragmens HIndlII kapcsolókkal való kiterjesztésével. (27. ábra) és Bspl-gyel történő hasításával állítjuk elő. HindlII-PvuII-vel hasított 404-es plazmid-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 26
