194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 Icotid szekvenciáját meghatározzuk. A szekvenciára bontás arra utal, hogy a 2H-M8 plazmid a PstI hely és az JFN-al első kodonja (CYS) között néhány nuklcotidot tartalmaz. így a Pstl-gyel emésztett 2H-M8 plazmidot T4 polinukleáz/dATP-vel, SÍ exonukleázzal kezeljük és Sáli gyei emésztjük. Ily módon az amino-terminális végüket nem tartalmazó JFN-al-t kódoló szekvenciák sorozatát kapjuk. Ezután ezeket Lac3-8 plazmidból EcoRI-gyel végzett emésztéssel SÍ exonukleázzal végzett kezeléssel és Sall-gyel végzett emésztéssel előállított GUALAC fragmenshez LAC irányításával hozzákapcsoljuk. Az így kapott plazmidsorozat az amino-terminális végüket különböző arányban nem tartalmazó IFN-al-t kódoló szekvenciákat a LAC promotert tartalmazó fragmenshez az óramutató járásával ellentétes irányban AUG-n keresztül kapcsolva tartalmazza. Néhány plazmidot ezek közül szekventálunk. Az egyik az IFN-al ötödik, a másik az IFN-al tizedik aminosav komplemensénél kezdődik. Az E. coli mlnisejtekben (DS410) mindkét plazmid az IFN-a hatását mutató polipeptideket termel. így az IFN aktivitás nem igényli a teljes IFN-al fehérjét. Hif-4c-ben lévő inszerttel gyengén kereszt-hibridizálódó DNS imzertekkel rendelkező, a Hif-2h fragmenstől eltérő restrikciós térképű rekombináns DNS molekulákat tartalmazó E. coli kiónok azonosítása Az autentikus limfoblasztoid interferon (Zoon et al. fenti közleményük és M. Hunkapiller, L. Hood — fenti közleményük) első 35 aminosáv komponensét és a Hif-2h fragmensből levezetett szekvencia 9 különbséget mutat. Valamennyi esetben a különböző aminosavakért felelős kodonok egy bázis megváltoztatásával állnak kapcsolatban. Az autentikus limfoblasztoid interferon aminosav összetételét egyrészt direkt úton meghatározva, másrészt a Hif-2h fragmens szekvenciájából leszármaztatva szintén feltűnő különbségeket tapasztalunk Gly, Pro, Cys és Met tartalom tekintetében. E különbségek túl nagyok alihoz, hogy polimorfizmussal magyarázzuk. E helyett a legvalószínűbb, hogy legalább két nemallelikus gén létezik, mivel a két fehérje közötti eltérés foka (26%-os hibás párosítás) hasonló például a humán és birka /3-globin közötti eltéréshez (23%-os hibás párosítás). így az előzőekben azonosított (1. fentiekben) Hif-4c fragmenssel gyengén hibridizáló kiónokat vizsgáljuk és ezek J.özül egyet, az E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-íl-206)) kiónt azonosítjuk. E klón Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 hibrid plazmjdja (HcIF-II-206) és DNS inszertje Hif-4c-vel és Hif-2h fragmenssel gyengén hibridizál. A Hif-II-206 plazmiddal transzformált E. coli által termelt polipeptidek a HuIFN-a biológiai vagy immunológiai hatásával rendelkeznek. A Hif-II-206 fragmens restrikciós térképe a Hif-2h fragmens esetén meghatározottól különbözik. A 11. ábrán a két restrikciós térkép összehasonlítását mutatjuk be. A Hif-II-206 fragmens restrikciós helyeinek abszolút helyzetét nem egyedül a restrikciós térképből határozzuk meg, Jianem a fentiekben ismertetett szokásos módszerekkel meghatározzuk az inszert nukleotid szekvenciáját, mely e helyek pontosabb meghatározását teszi lehetővé. Azonban a Hif-II-206 fragmens és Hif-2h fragmens restrikciós térképében mutatkozó különbségek arra utalnak, hogy a két inszert interferon génjeinek nukleotid szekvenciája különböző. A 12—16. ábrákon a HcIF-G kultúra inszertált DNS szekvenciájának - Hif-II-206 fragmensnek- nukleotid szekvenciáját, a HcIF-E kultúra (1.- Hif-2h fragmens - nukleotid szekvenciáját, és a nukleotid szekvenicák által kódolt fehérjék megfelelő aminosav szekvenciáját mutatjuk be. A HcIF-G kultúrából az N. M. Wilkie et al. által ismertetett B módszerrel [Nucl. Acids. Res., 7, 859-77. o. (1979)] elkülönített plazmid DNS Hif-II-206 fragmensének — a Psti I fragmensnek (790 b.p.), nukleotid szekvenciáját A. M. Maxam és W. Gilbert (1. fentiekben) módszerével határozzuk meg. A szekventálás stratégiáját a 17. ábrán szemléltetjük. Restriktált DNS-t (rendszerint kb. 10 /tg/t) 5’ terminálisán N. Mantei et al. módszerével [Gene, 10, 1-10. o. (1980)] jelezzük. A jelzett fragmenseket egy másik restrikciós enzimmel hasítjuk, a termékeket 5%-os poliakrilamjd gélen Trfsz-borát-EDTA pufferben [A. C. Peacock és C. W. dingman. Biochem., 6, 1818-27 (1967)] végzett elektroforézlssel különítjük el, majd a gélről extraháljuk és W. Muller et al módszerével [J. Mol. Biol. 124, 343— 58. o. (1978)] tisztítjuk. A 17. ábrán a szekventálás során kapott különböző fragmenseket mutatjuk be: 25 és 26 jelzésű fragmensek: a Hif-II-206-ot Pst I-gyel hasítjuk, jelezzük, BglII-vel hasítjuk, és egy Pstl*-BG1II fragmenst (257 bp) (25 jelű) és egy Pstl*-BglII fragmenst (279 b.p.) (26 jelű) elkülönítjük: 21, 22 és 23 jelzésű fragmensek: a Hif-II-206-ot PvuII-vel hasítjuk, jelezzük, BglII-vel hasítjuk és a PvuII*-BglII fragmenst (88 b.p.) (21 jelű), a PvuII**-BglII fragmenst (176. b.p.) (22 jelű) és a Pvul*-BglII fragmenst (214. b.p.) (23 jelű) elkülönítjük, 11, 12, 13 és 14 jelzésű fragmensek: a Hjf-II-206-ot BglII-vel hasítjuk, jelezzük, Pstl-gyel hasítjuk és a BglII* PstI fragmenst (279 b.p.) (14 jelzésű), valamint a Bglll**-Pstl fragmens és BglII*-BglII* fragmens együttvándorló keverékét elkülönítjük. Ezután a keveréket PvuII-vel hasítjuk, és a VglII*-Pstl fragmenst (257. b.p.) (13 jelzésű), a BglII*-PvuII fragmenst (176 b.p.) (12 jelzésű) és a VglII*-PvuII fragmenst (88 b.p.) (11 jelzésű) elkülönítjük. 27L, 27U, 43 és 45 jelzésű fragmensek: a Hif-II-206-ot Hinfl-gyel hasítjuk, jelezzük és a Hinfl*Hinfl* (113. b.p.) 27P jelzésű), Hinfl*-Hinfl* (146 b.p.) (28 P jelzésű), HinfT-HinfH (159 b.p.) (30P jelzésű), HinfT-HinfT (397 b.p.) (3 IP jelzésű) és Hinfl*-Hinfi* (1522 b.p.) (32P jelzésű) prekurzor fragmenseket elkülönítjük. Ezután a 28P jelű fragmenst MBoII-vel hasítjuk és a HinfI*-MboII (112 b.p.) (41 jelzésű) fragmenst elkülönítjük, a 30P jelzésű fragmenst MboII-vel hasítjuk és a HinfI*-MboII (126 b.p.) (43 jelű) fragmenst elkülönítjük, a 3 IP fragmenst Pstl-gyel hasítjuk és a Hinfl*-Pstl (151 b.p.) (44 jelzésű) fragmenst elkülönítjük, a 32P jelű fragmenst Pstl-gyel hasítjuk és a Hinfl*-Pstl (139 b.p.) (45 jelű) fragmenst elkülönítjük. A 27P jelzésű fragmens szálainak elkülönítésével két szálat kapunk (27U és 27L jelzésűek). Valamennyi szegmenst.a 27U és 27L jelzésűek kivételével, mindkét szálukon a restrikciós helyeken ke; resztül — melyek a szekventálás „kapászkodóiként szolgálnak — szekventálunk, kivéve a VglII helyet a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25
