194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 azokban az esetekben, amikor az szükséges, poliakrilamid gél elektroforézissel tisztítjuk (1. alább). 0,15 mólos NaG-t, 0,05 mólos Trisz-HG-t (pH = 8) tartalmazó oldatban lévő poliakrilamid (vagy agaróz) gélről elkülönített fragmenseket, 0,1 ml-es hidroxlapatit oszlopon (Biorad HTP) adszorbeáljuk, négyszer 1 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 7) mossuk, és 0,3 ml 1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 7) eluáljuk. Az oldatot tízszeresre hígítjuk, a DNS-t a fenti módon DEAE cellulóz oszlopon adszorbeáljuk és eluáljuk (W. Muller et al fenti közleményük). Etanollal történő ldcsapás után a DNS-t 5 terminálisán [T*2!*] ATP-vel (12-34 pCi/pmól DNS 5’ végek) és polinukleotid kinázzal (New England Biolabs vagy P-L Biochcmicals Inc.), lényegében A. M. Maxam és W. Gilbert fentiekben ismertetett módszerével, kivéve, hogy a kináz-reakció előt( a DNS-t nem denaturáljuk — jelezzük. A DNS 5 végek pmóljaiként 1 — 1,5 pCi fajlagos aktivitású [S*P] foszfátot kapunk. A szekvenciára bontás céljából a jelzett fragmenseket egy második restrikciós enzimmel hasítjuk, és a termékeket trisz-borát-EDTA pufferben 5%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel különítjük el. A kívánt fragmenseket a gélről extraháljuk és tisztítjuk (Muller et al. fenti közleményük). A szekvenciára bontás céljából az alábbi fragmenseket állítjuk elő (a szám adja meg a névleges fragmens lánchosszt bázis párban kifejezve, a jelzett helyeket *-gal jelöljük). 1) A Hif-2h Bspl-gyel végzett hasításával, a Bspl- BspI-232 és Bsp-I-Bsp-I-949 fragmenseket Loeningfélc pufferben 5%-os poliakrilamid gélen történő elektroforézisscl különítjük cl. (U. E. Loening ,,The Fraction Of High Molecular Weight Ribonucleic Acid By Polyacrylamid Gel Electrophoreses ’, J. Biochem. 102.0.(1967)). 2) A Hif-2h Bspl-gyel végzett hasításával, majd ezt követő jelzéssel, Pstl-gyel történő hasítással, a Bspl*-Pst-83 és Psp*-Pst-827 fragmenseket különítjük' el, 3) A Hif-2h BglII-vel végzett hasításával, majd ezt követő jelzéssel, Pstl-gyel történő hasítással, a BglII* -PstI-336 és Bgj‘-PstI-570 fragmenseket különítjük el, 4) A Hif-2h MboII-vel végzett hasításával, majd ezt követő jelzéssel, Pstl-gyel és HindlI-vel (a zavaró 350 bp.-ú pBR322 elhasítás céljából) történő emésztéssel, a MboII*-PstI-519 és MboII-ú-PstI-351 fragmenseket különítjük el. 5) A Hif-2h EcoRI-gyel végzett hasítással, majd ezt követő jelzéssel, Pstl-gyel történő hasítással, az EcoRI*-PstI-708 és EcoRI* Psti-198 fragmenseket különítjük el, 6) A Hlf-2h Pstl-gyel végzett hasításával, majd ezt követő jelzéssel, Bgjll-vel történő hasításával, a Psti*-BgJII-570 és Pst*-BglII-336 fragmenseket különítjük el. 7) A Hif-2h Avall-vel végzett hasításával, majd ezt követő jelzéssel, Pstl-gyel és BglII-vel történő hasítással az Avail #ú-Psti-186 és AvaII*-BglH-147 fragmenseket különítjük el. 8) A Hif-2h Pvull-vel végzett hasításával, majd ezt követő jelzésével, Pstl-gyel és BglII történő hasítással, a PvuII*-PstI-486 fragmenst különítjük el. A fragmenseket A. M. Maxam és W. Gilbert fenti módszerével - az 1978. szeptemberében ugyanezen szerzőknek a közjegyzői példányban leírt módosítások figyelembevételével - bontjuk részeire. A terméket 50 mmólos trisz-borátot és 1 mrnólos EDTA-t tartalmazó oldatban 0,1 x25 x 36 cm-es 12%-os poliakrilamid gélen (az akrilamid-biszakrilamid arány 18 : 1) végzett elektroforézissel frakcionáljuk 6 órás 700 V-on végzett előfuttatást követő 2, 8, 18 és 26 órás 900 V-on végzett futtatásokkal. A legjobb eredményeket akkor kapjuk, ha a géleket használat előtt szobahőmérsékleten 2-3 napon át tartjuk. A cDNS inszert mindkét szálában lévő szakaszokat szekventáljuk, továbbá a jelzett végként szolgáló valamennyi restrikciós helyet az azt átérő fragmenssel szekventáljuk. A kapott nukleotid szekvenciát a 8-10. ábrákon tüntettük fel. Ahogy az várható, így az inszerten belüli különböző restrikciós helyek helyzetét sokkal pontosabban határoztuk meg, mint csak egyedül a restrikciós enzimmel történő hasításnál, amelyet a 4. ábrán ábrázoltunk. Hivatkozva a 8—10. ábrákra, az inszert hetero polimer részét az 5’ terminálison 23 G gyök, a 3 terminálison 15 C gyökkel követett 7 A gyök (valószínűleg az mRNS poli(A) részét tükrözve) határolja. Az Inszertet a dG farokrész előtti első nukleotidtól a poli(A) részek előtti utolsó nukleotidig számozzuk. Az 57—59 helyzetben lévő ATG iniciáló triplett és a 624-626 helyzetben lévő TAA terminációs triplett nonszensz kódonokkal meg nem szakított leolvasási keretet határoz meg. Az inszert e területén lévő másik két leolvasó keret 18 illetve 12 nonszensz kodont tartalmaz. A többi szekvenciák, melyek eltérő leolvasó keretekben találhatók, és amelyek ATG-vel vagy GTG-vel és termjnádós jellel határoltak, amelyek 25 vagy több aminosavbói álló poljpeptidet kódolnak, a 226-304, a 640-778, valamint a 683-743 nukleotidok között helyezkednek el. így az a legvalószínűbb, hogy az 57-626 nukleotidok foglalják magukba a Hif-2H fragmens nukleotid szekvenciáját, amely - a találmánnyal összhangban - az IFN-a biológiai vagy immunológiai hatásával rendelkező polipeptidet kódolja. Nyilvánvaló, hogy a poli(A)RNS-bő] a szokásos módszerekkel (A. Efstratiadis ,et al. fenti közle ményük) előállított klónozott cDNS 5 terminális nukleotidokat nem tartalmaz, s mesterséges szekvendákat tartalmazhat [R. I. Richards et al, „Molecular Cloning And Sequence Analysis of Adult Chicken B-Globin cDNA , Nucleic Adds Research, 7, 1137-46. o. (1979)]. így nem bizonyított, hogy az 57-59 nukleotidoknál lévő ATG az autentikus mRNS első ATG részlete. A továbbiak miatt azonban feltételezzük, hogy az 57-59 nukleotldokban lévő ATG az autentikus mRNS első ATG részlete. Az inszert ezen része által kódolt polipeptidet összehasonlítva az autentikus humán limfoblasztoid interferon 35 amino-tenniális aminosav szekvendájával - SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArg-AlaLeuIleLeuLeuAlaGlnMetGlyArgDeSerLeuPhe-SerCysLeuLysAspArgHisAsp— melyet K. C. Zoon et al (fenti ködeményük) és M. Hunkapiller, L. Hood (fenti ködeményük) határoztak meg - megállapíthatjuk, hogy a választott leolvasási kere( helyes, és hogy az 57-124 nukleotidok az „érett polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát megelőző szignál szekvendát kódolhat, mivel az irodalmi 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
