194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 szekvencia jó egyezést mutat a meghatározottal (a 24 aminosavtól előre haladva a 35 aminosavból 26 esetén). , Az eukarióta mRNS-ekben általában az 5 terminális első AUG trlpletje a fehérjeszintézis Indító helye [M. Kozak, „How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions In Messenger RNA , Cell, 15, 1109-25. o. (1978)]. A Hif-2h fragmensben lévő, a Hinfoblasztid interferon első aminosav tagjának megfelelő kodon a távolságban van az első Aubtől és 14 kodon távolságban a másodiktól, ez arra utal, hogy az Interferont kódoló szekvenciát egy 23 (vagy kevesebb, valószínűleg 15) aminosavból álló, szignál peptldet meghatározó szekvencia előzi meg. A feltételezett szignál szekvenciák közül a hosszabbik 11 hldrofób aminosav meg nem szakított sorozatát tartalmazza (a rövldebb pedig 6 hldrofób aminosavból állót). A hldrofób részek ilyen felhalmozódása a szignál szekvenciákra jellemző [B. D. Davis és P. C. Tai, „The>; Mechanism Of Protein Secretion Across Membfanes ’, Nature,283, pp. 433-38 (1980)]. Az „érett IFN-a polipeptidnek megfelelő nukleotld szekvencia 498 nukleotidot tartalmaz, melyek 166 aminosavat kódolnak. Feltételezve, hogy karboxil-terminális lépés nincsen, az interferon polipeptld molekulasúlya 19 338. A kódoló szekvencia bázis összetételének 50%-a GC. Az interferont kódoló szekvencián belül használt kodon az emlős mRNS- ekre általában szerkesztettekkel [R. Grantham, et al., „Codon Catalog Usage And The Genome Hypothesis , Nucleic Acids Research, 8, 49-62 o. (1980)] egyezést mutat. Bármflyén megfigyelt eltérést az involvált kis számoknak tulajdoníthatunk. Nyilvánvalóan, a FBf-2h fragmens a 8-10. ábrán feltüntetett polipeptid szerkezetnél, az in vivo enzimekkel (pl. glikozálás) való kölcsönhatás okozta semmilyen változást nem vesz figyelembe. Tehát ez a szerkezet az in vivo termelt IFN-a-éval nem lehet azonos, de lehet nagyon hasonló, ha nem azonos, biológiai és immunológiai sajátságai tekintetében. Azonban e szerkezet nem zárja ki annak valószínűségét sem, hogy más módosítások, mint pl. egyszeres vagy többszörös mutáció, bázis szubsztitúció, törlések, inszertálások, inverziók vagy e szerkezet kémiai módosításai alkalmazásával IFN-a aktivitásával rendelkező vegyületeket ne lehetne előállítani. 3. Az inszertált IFN-acDNS pozitív szálának meghatározása A mRNS szekvenciájával azonos szekvenciájú DNS-szálat pozitív, komplementedét negatív szálnak nevezzük. Az IFN-acDNS inszert pozitív szálját az 5. ábrán bemutatott módon azonosítjuk. A Hif-2h DNS-t BglII restrikciós enzimmel hasítjuk, terminálisát * 5 P-foszfáttal jelezzük (a fentiekben ismertetett a Pstl-gyel történő hasítással kapott terminális rész jelzésével azonos módon), és a DNS-t Pstl-gyel emésztve egy hosszabb (545 bp. p.-ből (a pontosabb analízis alapján 570 b.p.-ből) álló) és egy rövidebb (340 b.p.-ből (a pontosabb analízis alapján 336 b.p.-ből álló) radioaktív fragmenst kapunk. E fragmenseket denaturáljuk, és indukált leukocita pofí-(A)RNS-sel 80% formamidot és 0,4 mól/liter NaClt tartalmazó oldatban - azaz olyan körülmények között, amelyeknél DNS-DNS újrakapcsolódás nem megy végbe (1. fentiekben) - hibridizáljuk. A nuklelnspvat, különösen a nem hibridizált SíP-DNS-t 2 elbontja - emésztjük, és a terméket poliakrilamid gélen elkülönítjük [R. F. Weaver és C. Weissmann, „Mapping Of RNj\ By a Modification Of The Berk-Sharp Procedure , Nucleic Acid Research, 7, 1175— 93. o. (1979)]. Autoradiográflás elemzés alapján kimutatható, hogy csak a rövidebb nukleotid fragmens hibridizálódik po]i(A)RNS-sel (csak ezt védi poli(A)-RNS): így az 5 -jelzett rövidebb nukleotid láncot negatív szálként azonosítjuk. Ennek megfelelően a pozitív szál orientációja a 4. és 5. ábrákon (jobb oldalon) bemutatottal egyezik meg. 4. Annak illusztrálása, hogy a nem indukált humán leukocitából származó poli(A)RNS Hif-2h DNS-sel nem hibridizálódik. Az előző pontban ismertetett kísérlettel azonos kísérletet végzünk, azzal a különbséggel, hogy poü-(A)RNS-ként nem indukált humán leukocita poü(A)-RNS-ként használunk, amelyet a Sendai vírussal indukált leukociták előállítási módjával megegyezően állítunk elő. így kimutatható mennyiségű jelzett DNS védését nem tapasztaljuk. Összehasonlítva az eredményeket az előző pontban ismertetettekkel, megállapíthatjuk, hogy a nem indukált sejtekből származó poli(A)RNS-hez képest, kevesebb, mint 1/20 mennyiségű a FBf-2h-val hibridizációs mRNS-t tartalmaz. Interferon hatásával rendelkező polipeptid szintézise Z-pBR322 (Pst) /HcIF-4c-nek megfelelő rekombináns DNS molekulákat tartalmazó E-coli segítségével A pBR322 PstI helye a /3-laktamáz (Penicillináz) génen belül helyezkedik el. így, abban az esetben, ha egy kódoló DNS szegmenst (pl. egy teljes gént vagy egy génrészletet tartalmazó DNS-t) helyes orientációjú és helyes olvasási keretet képező helyzetbe Egáljuk, egy összekapcsolt fehérjét kaphatunk, mely az inszertált DNS szekvenciával kódolt aminosav szekvencia előtt a /3-laktamáz amino-terminális részét tartalmazza (L. Vüla-Komaroff et al. fend közleményük). Ha az inszertált DNS szegmens saját iniciáló jelét tartalmazó DNS szekvenciát, és egy azt megelőző olyan szekvenciát tartalmaz, melynek terminációs jele a /3-laktamáz szekvenciával fázisban van, termináció és a második iniciáló jelnél ismételt iniciálás történhet, és így egy nem összekapcsolt, aktív fehérje keletkezhet (A. Ç. Y. Chang et al. fend közleményük). Abból a célból, hogy a Hif-4cnek megfelelő DNS inszertet, a /3-laktamáz. génen belül, a helyes leolvasó keret expressziójának megfelelően inszertáljuk, pBR322 néhány származékát, nevezetesen pKT279-et, pKT280-at és pKT287-et (melyek K. Talmadge módszerével — személyes közlése alapján (1979) - állítottuk elő) használunk. E származékok mindegyikében a PstI hely oly helyzetű, hogy az arra a helyre ligáit DNS inszert és a sorozat egy másik származékának PstI helyhez kapcsolódó inszertje különböző leolvasó keretben lesz (6. ábra), vagyis e sorozat alkalmazásával lehetővé válik a DNS-inszertálása a /3-laktamáz génbe mindhárom leolvasó keretben. A FBf-2h-ból Pstl-gyel kivágott inszertet a Hif-40 fragmens esetében Ismertetett módon állítjuk elő. 10 ng Hif-2h Pstí fragmenst Pstl-gyel hasított pBR322-vel, pKT279-cel, pKT-280-nal vagy pKT287-tel (mindegyik esetén 10 ngmal) 10 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5) 6 mmól/ liter MgClj-t, 100 mmól/liter NaCl-t, 6 mmól/liter ß-merkapto-etanolt tartalmazó oldat 20 /i-ét, 200 Mg/ml zselatint és 0,1 mmólos ATP-t tartalmazó 194 305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
