194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 104 305 2 kb. 1,2 ng és 0,2 ng közötti mennyiségű IFN-amRNS-t tartalmaz. Ha az IFN-amRNS lefordítási aránya az oocitákban egy nagyságrenddel kisebb, mint a globin-mRNS átlagos értéke, akkor a poli(A)RNS IFN-amRNS tartalma a fend számítottnál tízszer nagyobb lenne, vagyis 1 : 1000 és 1 : 5000 közötti érték. Továbbá, e/ esetben 12 /tg poli(A)RNS kb. 12 ng és 2 ng közötti mennyiségű IFN-amRNS-t tartalmazna. Másrészt, ha az IFN-amRNS lefordítási aránya az oocitákban a globin-mRNS átlagos értékénél egy nagyságrenddel nagyobb lenne, akkor a poli(A)RNS IFN-amRNS tartalma a fentiekben számítottnál tízszer alacsonyabb lenne, azaz kb. 1 : 100 000 és 1 : 500 000 közötti érték. így tehát 12 /tg poli(A)RNS 0,1 ng és 0,02 ng közötti mennyiségű IFN-amRNS-t tartalmazna. A pBR322 plazmid 4361 bázispárt tartalmaz. Ha az IFN-amRNS teljes cDNS-nek kb. 800-1000 bázispáiját a pBR322-höz adjuk, akkor kb. 5200- 5400 bázispárt tartalmazó pBR322-IFN-acDNS-t kapjuk, melynek molekulasúlya kb. tizenkétszerese (2x5200/800) az IFN-amRNS molekulasúlyának, így a vizsgálathoz szükséges, 12 pg poli(A)RNS-ben jelenlévő IFN-amRNS (melyet a fenti számítással hatrozunk meg) kötéséhez sztöehiometrikusan számítva, az IFN-amRNS-hez képest tizenkétszeres mennyiségű rekombináns DNS-re van szükségünk. Mivel a rekombináns DNS molekula előállítására használt poll(A)RNS IFN-amRNS tartalma a nyers poli(A)RNS-hez képest 10-40-szeres, az 512 klónból áBó csoport a kívánt IFN-amRNS-t tartalmazó klónokból a fentiekben számítottnál 1040-szer annyit tartalmaz. Ha 1000 rész nyers poli(A)RNS 1 rész IFN- amRNS-t tartalmaz, és az IFN-acDNS plazmid sztöchiometrikus mennyisége 144 ng. Mivel az 512 klónból álló csoportban legalább 5 tartalmazhat IFN-acDNS inszertet, a teljes kívánt hibridplazmid DNS mennyisége 14,8 /lg (144x512/5 x l(r). Ha egy rész IFN-amRNS 10 000 részben van jelen, akkor 12 ng poli(A)RNS 1,2 ng IFN-amRNS-t tartalmaz, és a kívánt IFN-acDNS plazmid mennyisége 14,4 ng. Ha az 512 klónból áfló csoport 0 vagy i IFN-acDNS inszertet tartalmaz, a teljes kívánt hibrid plazmid DNS mennyisége 0,74 /lg (I,44x512xl0'3). Abból a célból, hogy biztosítsuk, hogy a hibridizációs reakció DNS felesleg jelenlétében (azaz poli(A)RNS-hez képest feleslegben vett rekombináns DSN jelenlétében) menjen végbe, a vizsgálatban 20 /lg mennyiségű elegyet (kb. 1,4 -30-szoros felesleg) használunk. A hibridizációt olyan körülmények között kell végeznünk, hogy a) a poli(A)RNS hibridizált részét változatlan és biológiailag hatásos formában különíthessük el, b) nem-specifikus DNS-mRNS asszociátumok keletkezését megakadályozzuk, c) a hibridizációs reakció legalább 75%-os átalakulási fokig menjen végbe. __ ____ _______ E feltételek leginkább akkor teljesülnie, ha a hibridizációt 80% formamldot és 0,4 mól/liter NaC-t tartalmazó rendszerben végezzük [J. Casey és N. Davidson, „Rates Of Formation And Thermal Stability Of RNA : DNA And DNA : D£JA Duplexes At High Concentrations Of Formamide . Nuclein Acids Res., 4, 1593-52. o. (1977)]. Ekkor kb. 40°C hőmérsékleten (inkább a hőmérsékleten, mint a formamidot nem tartalmazó reakció esetén alkalmazott 60—70 C- on) végezhetjük a reakciót. Alacsonyabb hőmérsékleten előnyösebb végrehajtanunk a reakciót, azért hogy minimálisra csökkentsük a poli(A)RNS károsodását. Ezért 56°C hőmérsékleten végezzük a hibridizációt. Ez kb. 3°-al alacsonyabb a T J F2 i értéknél (J. Casey és N. Davidson fenti közleményük) és kb. 10—13°-kai alacsonyabb a T, j értéknél [Hamaguchi et Geidushek, J. Amer. Chem.Soc. 84, 1329. o.)] így e hőmérséklet 87%-nál kisebb homológjával szekvend hibridizációját nem teszi lehetővé, mivel 1%-os hibás párosítás a T, pj értéket l°-kal csökkenti [T. F. Bonner et al., „Reduction In The Rate Of DNA Reassodation By Sequence Divergence”, J. Mol. Biol., 81, 123-35. o. (1973)]. A jelen esetben a DNS önhibridizádója nem jelent komoly problémát, mivel a használt DNS-ek keveréke ugyanabból a vektorból (pBR322) és cDNS inszertek változataiból tevődik össze. így a DNS szekvenciák legnagyobb része heteroduplex, melyben az inszertek poli(A)RNS-hez vezető hibridlzádó számára hozzáférhetők. Nagyon valószínűtlen, hogy a különböző duplexek részét képező komplementer cDNS inszertek egymásra hassanak, a meglévő topológiai gátoltság miatt. Végül is az alkalmazott reakciókörülmények között a DNS-DNS újraegyesülés minimalizálható (J. Casey és N. Davidson fenti közleményük). A legalább 75%-os átalakuláshoz szükséges hibridizációs időt az alábbi másodrendű sebességi egyenlet alapján határozzuk meg. t= In -£o.t.Rq +.Ro 0 -_) =3,9 óra Q )' Co Ro kR (Co - Ro) ahol R = hibridizált RNS moláris nukleotid koncentrációja Co= hibridizálandó DNS kezdeti moláris nukleotid koncentrációja Ro= hibridizálandó RNS kezdeti moláris nukleotid koncentrációja kp = RNS-DNS hibridizáció sebességi állandója t = idő (másodpercben) és R = 0,75 (75%-os átalakulás) Ro kR = 472 (kp = 1/12 krf (J. Casey és N. Davidson fenti közelményük) ahol k^= a DNS-nek a választott hibridizádós körülmények között megfelelő másodrendű sebességi állandója, és kd = 1,7 x 10s Ll/2 x N1 (J. R. Hutton és J. G. Wetmur, „Renaturation Of Bacteriophage X174 DNA-RNA Hybrid: RN\Length Effect And Nucléation Rate Constant J. Mol. Biol. 77, 495-500o.(1973) L = 900 (lánchosszúság bázispárban kifejezve: a teljes IFN-acDNS Inszertben kb. 900 található). N = 900 (a hibrid lánc összetettsége bázispárban kifejezve, ez az érték 900, minthogy az IFN-amRNS 900 nukleotidja az IFN-acDNS Inszert 900 komplementer nukleotidjához 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
