194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 kapcsolódik) Co= 2,5 x 10‘7 (annak alapján, hogy a vizsgálatban használt, előzőekben meghatározott rekombináns DNS 20 pig-ját tartalmazza 40 fi oldat, Ismételten feltételezve, hogy az IFN-acDNS inszert a rekonibináns DNS molekula 1/12-e, és az 512 klón közül legalább egyben előfordul, továbbá, hogy egy DNS bázispár átlagos molekulasúlya 662). Ro = 8,7 x 10 * (annak alapján, hogy a vizsgálatban használt, előzőekben meghatározott poli(A)-RNS 12 jug-ját tartalmazza 40 fi oldat, ismételten feltételezve, hogy a poli(A)RNS 1 : 10 000 rész IFN-OmRNS-t tartalmaz (DNS nagy feleslege, különböző arányban, a hidridizációs sebességet csak kis mértékben befolyásolja), továbbá, hogy ribonukleid RNS átlagos molekulasúlya 343). 3. Az első vizsgálat kivitelezése A lépés: Rekonibináns DNS molekula-keverék előállítása és elbontása A kívánt számú bakteriális kiónnal a fentiekkel kiegészített tripton agar lemezre- valamennyi mikrotitráló üregből kivett alikvot résszel, megfelelő mechanikus eszköz segítségével — ráoltunk. 37°C hőmérsékleten végzett inkubáció után mindegyik klón néhány mm-es átmérőjű teleppé fejlődik. Ezután a lemez(ek)bő] a telepeket kimossuk, egyesítjük és 2 1-es Erlenmeyer lombikban lévő, 100 jüg/ml pimelinsavval, 10 pg/ml nalidix-sawal és 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített 1 1 tripton táptalajra oltjuk. A kultúrát 37°C-on látszólagos OD^q = kb. 0,8 értékig (melyet vizuálisan becsülünk meg) rázatjuk, és egy rész kiegészített tripton táptalajt, valamint 170 pg/inl mennyiségig klóramfenikolt adunk hozzá, majd 37°C-on 16 órán át rázatjuk. Majd 20 ml kloroformot adunk a kultúrához, és a baktériumok elpusztítása céljából 10 percen át 37°C hőmérsékleten ismét rázzuk (€. Weissmann és W. Boll, fenti közlemények). A kultúrát a kloroformról dekantáljuk, és a sejteket 6000 fordulat/perc fordulatszámmal 4°C hőmérsékleten 15 percen át történő centrifugálással (Sorvall GS3 típusú rotor) különítjük el. így mindegyik 1 1-es készítményből kb. 1—2 g súlyú testet kapunk. A sejteket 30 ml 20 mmólos Trisz-HQ-ben (ph = 7,5) szuszpendáljuk, és 5000 fordulat/perc fordulatszámon 4bC hőmérsékleten 20 percen át centrifugáljuk (Sorwall SW típusú rotor), majd 30 ml 50 mmólos Trisz-HG-ben (pH = 7,5) ismét szuszpendáljuk. Ezután 0,25 rész lizozim oldatot (50 mmólos Trisz-HG-ben 10 mg/ml (pH = 7,5), majd 10 percen át 0°C hőmérsékleten történő hűtés után 0,33 térfogatrész (az eredeti 50 mmólos Trisz-HG - kultúra szuszpenzió térfogatára vonatkoztato'tan), 0,5 mólos EDTA-t (pH = 8,0) adunk hozzá és rázás nélkül óvatosan keverjük. Ismét 10 percen át 0°C hőmérsékleten tartjuk és 1/16 térfogatrész (ismét az eredeti térfogatra vonatkoztatva) 2%-os Triton X-100-at adunk hozzá. 60 perc múlva 60 percen át 0°C hőmérsékleten 10 000 fordulat/ perc fordulatszámon Sorwall SW rotorban centrifugáljuk. A felülúszót mágneses keverővei ellátott lombikban keverés közben annyi 3 mólos NaOH oldattal kezeljük, amíg 2O7C hőmérsékleten a pH * 12,5 értéket elérjük (a pH-t Orion Research 601 típusú üvegelektróddal ellátott pH-mérővel mérjük, melyet előzőleg 3505 számú Beckman pH 10 Carbo-2 nate Buffer Standard-del hitelesítünk), 10 percen át e hőfokon keverjük, majd a pH-t pH « 8,5 értékre állítjuk be. 3 perc további keverés után 1/9 térfogatrész 5 mólos NaG-t és 1 térfogatrész (desztillált és 9,5 mólos NaG oldattal ekviUbrált) fenolt adunk hozzá és az erős keverést 5 percen át folytatjuk. A fázisokat 10 00 fordulat/perc fordulatszámon Ó°C-on 10 percen át GSA Sorvall rotorban történő centrifugálással elkülönítjük. A felülúszó - amely a I DNS-t (cirkuláris kettősláncú DNS) tartalmazza — a köztes fázistól - mely egyláncú DNS-t tartalmaz - elválasztjuk, és kloroformmal háromszor extraháljuk (e lépésben a fenol nagy részét el kell távolítanunk). A I DNS frakció azokat a rekonibináns DNS molekulákat (pBR322-cDNS inszertet) tartalmazza, amelyeket eredetileg a vizsgálatra kiválasztott 512 klón részét képező gazdasejt átalakításában használtunk. A I DNS-hez 20 pg/ml koncentráció eléréséig 5 mg/ml-es 85°C hőmérsékleten 10 percig előkezelt pankreász RNS-áz A t adunk és a keveréket 37°C-on 60 percig inkubáljuk. Ezután 1/5 rész 5 mólos NaG-t, majd 7,5% polietlléngUkol 6000-t (Union Carbide: 20 percen át 120PC hőmérsékleten autoklávozott) adunk hozzá. 2—16 órán át —10°C-on tartjuk, és a kivált anyagot Sorvall SW rotorban 8000 fordulat/ perc fordulatszámon 0°C hőmérsékleten 20 perces centrifugálással elkülönítjük, majd annyi 0,075 mólos NaG és 0,0075 mólos nátrium-citrát oldatban oldjuk fel, hogy 260 nm-en mért 20 abszorbencia értéket kapjunk és 0,5% SDS-t állítunk be. Ezután 30 percen át 37°C-on 0,5 mg/ml koncentrációjú pronázzal (2 órán át 37°C-on 20 mg/ml koncentrációban ön-emésztett enzim) inkubáljuk és 1 térfogatrész desztillált fenollal háromszor, 1 térfogatrész kloroformmal kétszer extraháljuk. A mintát (1 mg/ ml DNS oldatból 2 ml térfogatig) 5—23%-os répacukor gradiensen 50 mmól/liter Trisz-HG-t (pH = 7,5) és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban 21 000 fordulat/perc fordulatszámon 15°C hőmérsékleten 15 órán át SW 27 Beckman rotorban centrifugáljuk. A frakciók értékét meghatározzuk és a DNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd nátrium-acetáttal és etanollal a DNS-t kicsapjuk. 20—100 jug súlyú I DNS-t centrifugálással elkülönítünk. 20 /ig tisztított I DNS-t 15Ö jtd, 10 mmól/liter Trisz-HG-t (pH = 7,5), 6 mmól/liter MgGj-t, 50 mmól/liter NaCl-t, 6 mmól/liter 2-merkaptoetanolt, 200 /rg/ml BSA-t vagy zselatint és 20 egység Hind III-t (New England Biolabs) tartalmazó oldattal emésztünk. A lÜnd ül restrikciós enzim az I DNS-t a pBR322 részen belüli helyen hasítja el (Valószínűtlen, hogy a cDNS rész is hasad, ha azonban ez mégis bekövetkeznék, a vizsgálatot lényegében nem befolyásolja.) 37°C hőmérsékleten való 2 óra állást követően alivot részét (1%-ot) 1%-os agaróz gélen 50 mmól/liter Trisz-acetátot (pH » 7,8) és 2 mmól/ liter EDTA-t tartalmazó oldatban 1 óra hosszat 50 mA-es áramerősséggel végzett elektroforézissel analizáljuk, így megállapítva, hogy az emésztés végbement-e. Amennyiben nem, úgy még adunk hozzá Hind III enzimet és az inkubálást 2 óra hosszat folytatjuk. Amikor az I DNS teljesen átalakult lineáris molekulákká, 0,5 mg/ml koncentráció eléréséig pronázt (Calbiochem), 10 mmólos, illetve 0,5%-os Koncentráció eléréséig EDTA-t, Ül. SDS-t adunk hozzá, és 30 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk 5 1C 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
