194304. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált enzim aktivitásának szintentartására
1 194 304 2 gának a legnagyobb meghatározó tényezője annak az időtartamnak a hossza, ameddig az enzimtöltés hatásos marad. Ahogy az előzőekben említettük, az enzim természetes úton bomlik az eljárás előrehaladtával. JóDehet nem ragaszkodunk egy meghatározott elmélethez az enzimbomláshoz kapcsolódóan, de úgy véljük, hogy a hőhatás és a kémiai befolyás hozzájárul a bomláshoz. Ennek a problémának a megoldása az, hogy csökkentjük a reagensek átfolyását az immoblizált rendszeren, amint a rendszer hatásossága csökken. Mivel azonban az átfolyási sebesség 10 vagy nagyobb faktorral változhat, arra van szükség, hogy egy kolonnasort hozzunk létre annak érdekében, hogy biztosítsuk a folyamatos teljesítményt. Máj; , megoldás _az lehet, hogy szabályos időközökben leállítjuk a rendszer működését, eltávolítjuk a kimerült enzimet és újra töltjük friss enzimmel a hordozóanyagot vagy — ahogy a 3,960.663 számú USA-beli szabadalomban leírták — meghatározott időközökben friss enzimet adagolunk és a kimerült enzimet az elutáumba vezetjük. A találmány szerinti módszer az előzőekben említett eljárás megközelítése annyiban, hogy friss enzimet adhatunk a rendszerhez anélkül, hogy szüneteltetnénk a műveletet, a teljesítményt állandó szintben tarthatjuk vagy — kívánt esetben — növelhetjük és a távozó folyékony tennék lényegében mentes marad kimerült enzimtől. A találmány szerinti eljárás olyan módszert ad, amelynél az immobilizált rendszer készítésének a kezdetén az enzimet olyan mennyiségben- adjuk a hordozóanyaghoz, amely kevesebb az adszorbens legnagyobb felvevőképességénél, például a hordozóanyag nem teljes mértékben töltött, így az állandó teljesítményt fenntartjuk friss enzimnek a bevitelével, amint az szükséges, mindaddig, ameddig a hordozóanyag legnagyobb felvevőképességét el nem éljük. Mivel az immobilizáláson nyugvó adszorpciós módszerek visszatükrözik az enzimtöltés és a hordozóanyag közötti kölcsönhatásokat, az enzim és a hordozóanyag közötti hidrofób kölcsönhatásokat és hasonló jelenségeket, a különleges enzim-hordozóanyag kombináció megválasztását tapasztalati úton kell meghatározni. Használható hordozóanyagok a következők: 1. Gyengén bázisos poUsztirolgyanták, így az Amberlite IRA-93, Diaion WA-30, Diaion WA-11, Amberlite IR-45, 2. Gyengén bázisos (-N/R)2 fenol-formaldehidgyanták, így a Duolite EA-561, Duolite ES-562, Duolite ES-568, 3. Erősen bázisos ( N/R)3polisztirol-gyanták, így az XE-352, Amberlite IRA-900, Amberlite IRA-904, Amberlite FRA-938, GIA-01, Diaion PA-308, Diaion PA-304, Diaion SA-21 A, Sumitomo Resin, 4. Micellás enzimadszorbensek, ífey a DEAFSephadex (derivált térhálósított dextrán), DEAEGlycophase (szabályozott pórusú szénhidráttal bevont és derivált üveg), OAE-Glycophase (erősen bázisos a fentihez képest), DEAE-Biogel A (derivált térhálósított agarózgél gömbök), Selectacel DEAE ■cellulóz granulátum), Vistec D2 és D3 (DEAE- cellulóz granulátum viszkózból), DEAE Sephacel (gömbalakú DEAE-cellulóz), DEAE-cellulózgömbök (4,080.022 számú USA-beÚ szabadalom), szabályozott pórusú üveg és szabályozott pórusú alumíniumoxid, titándioxld, cirkóniumoxld. Előnyös olyan hordozóanyagok használata, amelyek gyengén bázikus anioncserélő anyagok. Legelőnyösebbek a DEAE-Sephadex vagy a DEAE-Cellulose típusú hordozóanyagok. Az enzimek széles változata adszorbeálható a fenti hordozóanyagokra. A megfelelő hordozóanyagot a szakember könnyen kiválaszthatja anélkül, hogy szüksége lenne kísérletezésre. Az előnyösen alkalmazható enzimek a glukóz-izom eráz, a glukoamfláz, az aminoacüáz, invertáz, /1-glukamáz, a glukóz-1-oxidáz és a glukóz-2-oxjdáz'. Abban az esetben, ha az immobflizálás egyedül elektrosztatikus vonzáson alapszik, akkor lehetőség van a kötések szétbontására, ha az ionerősség, pH vagy a reakcióhőmérséklet változik. Előnyös, ha olyan enzimet választunk, amely nagyon erősen kötődik a hordozóanyaghoz annak érdekében, hogy a lehető legkisebbre csökkentsük ezeket a hatásokat. Más változatban lehetőség van a protein-töltés növelésére kémiai módosítással, ahogy ezt amílo-glukozidázzal végezte Solomon és Levine [Biotechn. Bioeng. 16 : 1161 (1974)]. Egy különösen használható enzim a találmány szerinti gyakorlatban a glukóz-izomeráz. Az alábbi példákban, melyek a találmány szemléltetésére szolgálnak, az eljárást részletesen leírjuk egy különleges enzim/hordozóanyag kombinációra. 1. példa Ebben a példában azt írjuk le, hogy szabályos időközökben részben tisztított, oldható glukózizomerázt viszünk be egy izomerációs reaktorba, amely részben töltött vivőanyagot tartalmaz és ezt olyan mennyiségben visszük be, hogy lényegében állandó izomerizációs sebességet tartsunk fenn emelt szinten további 19 hétig. Az oldható enzim tisztítása 1460 ml mennyiségű Streptomyces rubiginosus fermentációs táptalajt szűrünk és a sejteket ismét szuszpendáljuk 730 ml ionmentesített vízben, majd még kétszer szűrjük. Ezután a sejteket feliszapoljuk 1460 ml ionmentesített vízben. A szuszpenzió pH- ját 6,5-re állítjuk be hígított HCl-lel és 10 mg lizozjm-ot és 1700 ppm Variquat-ot (dimetil-alkilbenzilammónium-klorid) adunk hozzá. Az elegyet 40°C-on 3,6 óra hosszat inkubáljuk óvatos felső keverés közben annak érdekében, hogy kivonjuk az oldható izomerázt a sejtekből. Az oldható enzimet szűréssel kinyerjük a roncsolt sejtekből és vizsgáljuk 18 IGIU/mlnél. [Lloyd, N. E., Khaleeluddin, K és Lamm, W. R. (1972), Cereal Chem. 49, 544 oldal irodalmi helyen ismertetett módon]. Az IGIU (International Glucose Isomerase Unit — nemzetközi glükóz izomeráz egység) az enzim olyan mennyisége, amely katalizálja D-glükóznak D-fruktózzá való átalakítását 1 pmól/ perc sebességnél és meghatározott körülmények kö-_ zött (pH = 7,0, 60ÖC, 2,0 mól glükóz, 0,2 mól Mg**, 0,001 mól Co ,’ 0,2 mól nátrium-maleát-puffer). Vivőanyag immobilizáldshoz Oldható glükóz-izomeráz immobüizálásához granulált DEAE-cellulózt (GDC) használunk. Az általános készítési mód abban áll, hogy őrölt cellulózt és nehezítő anyagot műanyaggal agglomerálunk és utána a cellulózt dietfl-aminoetfl-kloriddal reagáltatjuk annak érdekében, hogy gyenge bázisú anyaggá alakítsuk, ahogy a 4,355.117 számú USA-beli szabadalomban le van írva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
