194304. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált enzim aktivitásának szintentartására
1 16 kg C-100 őrölt cellulóz és 11 kg kaldnált alumínluni-oxjd keverékét 27 kg nagy szilárdságú polisz ti r óllal 200°C-os hengerszéken addig kezeljük, ameddig a műanyag meg nem olvad és a keverék homogén nem lesz. A granulált homogén cellulóz-elegyet lehűtjük, megőröljük olymódon, hogy többször átvisszük kalapácsos malmon és utána szitáljuk valamely 40-80 mesh méretű szitán (USA szabvány) Ilyen szemcseméretű frakció elkülönítése végett. A szitált anyagból 16 kg-ot feBszapolunk olyan alkáll-szulfát-oldattal, amely 17 kg nátrium-szulfátot, 2,2 kg nátrium-hidroxidot és 19 liter vizet tartalmaz. A szuszpenziót 40°C-ra melegítjük, és 6,4 kg 50 %-os dietíl-aminoetíl-klorid-hidroklorid vizes oldatot adunk a szuszpenzióhoz keverés közben 115 ml/perc sebességgel (körülbelül 1 óra leforgása alatt). A szuszpenziót további 30 percig keverjük, 3,2 liter 50%-os NaOH-oldatot adunk hozzá és újból hozzávezetünk 6,4 kg 50%-os dietil-aminoetil-klorid-hidroklorid-oldatot. A szuszpenziót 60°C- ra melegítjük, 57 liter vízzel hígítjuk, a pH-t 4,5-re állítjuk be HCl-lel és 60 mesh méretű rázószitán mossuk. A GDC-t ismét feliszapoljuk, a pH-t 7,0— 7,5-re állítjuk be és egy 0,25 mm szita lyukbőségfl szitán víztelenítjük. A vivőanyag adszorpciós felvevőképességét úgy méijük, hogy 100 ml oldható enzimet adunk 2,63 g száraz bázisos vivőanyaghoz, a pH-t 7,0-re állítjuk be és a szuszpenziót óvatosan keverjük 5 óra hosszat. Az adszorpciót úgy követjük, hogy egyenértékű mennyiségeket meghatározott időközökben szűrünk és mérjük az oldható izomeráz aktivitását. -Idő Oldható aktivitás Adszorbeált óra IGIU/ml 0 18,0 0 0,25 12,7 29,4 1 5,8 67,8 2 2,5 86,1 3 1,2 93,3 4 0,4 97,8 5 0 100 A vivőanyag mért felvevőképessége oldható izomerázra körülbelül 584 lGIU/g szárazanyag. Kezdeti enzim-immobilizáTás GDC-n GDC vivőanyagot részlegesen töltünk oldható izomerázzal körülbelül 25% felvevőképességig. Ennek során GDC-t (14,8 g szárazanyag) feliszapolunk ionmentesített vízben és a pH-t 7,0-7,1 -re állítjuk be. A szuszpenziót levegőmentesítjük vízsugárszivattyúval létesített vákuumban szobahőmérsékleten 60 percig és utána 24 mm átmérőjű és 288 mm hosszú Ace Glass Adjustachrom köpennyel ellátott üvegkoloniában töltjük, amely frlttelt fenékkel rendelkezik. Az ágyat 85 mm mélységig megtöltjük. Ezután üveggömböcskéket helyezünk az ágy tetejére (96 mm) az áramlás elosztására. A GDC-t megtöltjük olymódon, hogy 145 ml (2600 IGIU) oldható izomerázt folyatunk lefelé az ágyon keresztül 1 ml/perc sebességgel szobahőmérsékleten. Oldható aktív anyag nem megy át az ágyon. Immobilizált izomerűz-aktivitás vizsgálata A vízköpenyt a kolonnán 61°C-ra temperáljuk, majd 50%-os kristályos glükóz-oldatot, amelynek a Síi ja 7,8 és 5 mmól MgSO«-et, valamint 5 mmól lallSOj-at tartalmaz, Indítunk lefelé az immobflizált I/.omerá/.-ágyon át 0,4 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopot 16 óra hosszat járatjuk. Elemzés 2 céljára ezután mintát veszünk a termékből és az immobflizált Izomeráz aktivitását a következő egyenlettek meghatározzuk. b = RC I. —I„ Et Tqr ta Ç-f* Ebben a képletben E{ ■ teljes Immobilizált aktivitás IGIU-ban R : átfolyási sebesség ml/órában C => monoszaharid-koncentráció g/ml-ben kr = reakciósebességi állandó 61 °C-on 1 (0,019 g/IGIU/óra) I = távozó tennék izomerá dós foka _ fruktóz-koncentrádó______ monoszacharid-koncentrádó I = I beáramló anyag = 0 kristályos dextrózra r = I egyensúlynál = 0,510 61 Cr -on e Az I izomerációs fokot polarimetriásan méri ük a következő módon. A kolonnába bevitt anyag és a távozó tennék mintáit 20-szorosára hígítjuk ionmentesített vízzel, majd 1 óra hosszat állni hagyjuk azért, hogy a rotációs egyensúlyt elérjük. A rotációs méréseket Perkin-Elmer Model 241 polariméteren mérjük 25 C°-on egy 576 nm hullámhosszúságú higanyforrással. Az eszközt vízzel nullázuk a cellában és a rotáclóértékeket a hígított betáplált anyag és a távozó tennék fokában méijük. bemenő rotádó - kimenő rotádó * “ g monoszacharid/ml hígított bemenő (x faktor) vagy elmenő anyag (2) ahol I = I -10 faktor = z~T.——^-7—^ L((ad] - [a,-]) D = hígítás! faktor (5 ml — 100 ml) = 20 L = polariméter cellahossza - 1 dm [a.j - [ad = fajlagos rotádó (forgatóképesség) változása aszta glükóznak tiszta fruktózzá történő alakítására: higanyfénnyel mérve = 167,35 faktor = 0,1195 A kísérleti módszerrel meghatározott ImmobÖizált aktivitás 1548 IGIU-nak adódott, amely azt mutatja, hogy a vivőanyagra töltött 2600 IGIU oldható aktivitásból 60% jelent immobilizált aktivitást. Izomerizálás és enzirmdagolds szabályos időközökben Szárazanyagra számítva 95% glükózt, 5 mmól MgS04-et és 5 mmól NaHSOa-at tartalmazó 50%-os kukóricakeményítő hldrolizátum-oldat pH-ját 7,8-ra állítjuk be és elkezdjük lefelé folyatni immobilizált Izomeráz-ágyon keresztül 61°C-on. A kezdeti átfolyási sebességet az (1) egyenletből számítjuk, amely szerint a fruktózzá történő átalakulás körülbelül 44%nak adódik. Ezt körülbelül 17 ml/óra átfolyási sebességet állandóan fenntartjuk, kivéve az immobilizált aktivitás mérése alatt. A távozó termék fruktóztartalmát lényegében az Izomerizádó fokának a meghatározására leírt módszerrel méijük fruktóz%= 100 Ij, e képletben d = a távozó termék monoszacharid tartalma az összes szárazanyag részeként kifelezve. A fruktózszint fokozatosan körülbelül 40%-ra csökken 16 napos Időszak alatt. Ekkor először adagoljuk az oldható enzimet. Az immobilizált aktivitás vizsgálata azt mutatja, hogy körülbelül 800 IGIU 194 304 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
