194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
1 194 303 2 A találmány tárgya eljárás nukleozid-trifoszfát-függő 1 -metfl-hidantionáz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására. ' Az analitikai kémiában, különösen a klinikai-kémlai diagnosztikában állandóan növekvő igény van természetes anyagok, biológiai anyagcseretermékek és ezekből levezethető vegyületek kimutatására szolgáló enzimes eljárásokra. Az alap az enzimkatalitikus anyagátalakítások rendkívül nagy fajlagossága, ezek gyors, meghatározott és veszteségmentes lefutása enyhe reakciókörülmények között — rendszerint 15 és 40°C között vizes közegben és semleges pH-tartományban - valamint az a lehetőség, hogy ezeket egyszerű és érzékeny módon, különösen fotometriás mérési módszerekkel vagy közvetlenül vagy kapcsolt indikátorreakciók segítségével kvantitatíve nyomonkövethetjük. Az 1-metil-hidantoinra eddig semmilyen enzimkatalitikus átalakítási eljárás nem volt ismert, amely ezt a vegyületet közvetlen vagy közvetett enzimes analízis számára hozzáférhetővé tette volna. Pedig egy ilyen eljárás többek között különösen értékes lenne a kreatininnek, egy klinikai-diagnosztikailag fontos szérum- és vizeletalkotórésznek a meghatározására, amely egy hosszú ideje ismert enzimreakcióban a kreatinin-iminohidráz (E. C. 3.5.4.21) segítségével 1-metíl-hidantoinná és ammóniává alakítható át. Kreatinin szérumban vagy vizeletben való enzimes meghatározására ugyan már több eljárás ismert [Wahlefeld, A. W., G. Holz und H. U. Bergmeyer, Methoden der enzimatischen Analyse, 3, kiadás, II. kötet, Verlag Chemie, Weinheim 1974, 1834- 1838. old.; Fossati, P., L. Prencipe and G. Berti, Clinical Chemistry 29, 1494-1496. (1983); Tanganelli, E., L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiaghi and E. Murador, Clinical Chemistry 28, 1461-1464 (1983)] ezeknek azonban mind megvan az a hátrányuk, hogy a reakciösorozat közbenső termékeként vagy kreatinon (Wahlfeld et al.: Fossati et al.) vagy ammónián (Tanganelli et al.), vagyis olyan anyagokon át futnak le, amelyek kezdettől jelen vannak változó és a kreatininhoz képest jelentősen számításba jövő koncentrációkban az analizálandó szérumilletve vizeletmintában. A kreatinin-meghátárazáshoz tehát két elkülönített vagy egymás után kapcsolt reakciószakasszal történő különbségmérésre van szükség: egyikre, amelyben először a szabad kreatinint illetve ammóniát határozzák meg, valamint egy másodikra, amelynek során vagy kreatinin-aminohidroláz (E. C. 3.5.2.10) vagy kreatinin-iminohidroláz (=krcatinin-dczimináz) hozzáadásával a kreatininből utólag keletkező kreatin-, illetve ammónia-mennyiséget határozzák meg („minta)vakérték-eljárás” vagy „E, (E2-eljárás) . Ilyenfajta eljárások a manuális kivitelezés miatt viszonylag költségesek, és automatizált analízisrendszerekre is csak nagyőn korlátozottan alkalmazhatók, főleg akkor, ha az átalakítási reakciók teljes lefutásához hosszabb inkubációs idők szükségesek. Noha lényegében a reakciókörülmények megfelelő kiválasztásával a kreatinin-meghatározás a vakérték mérés elkerülésére ismert enzimes módszerekkel az úgynevezett kinetikus „flxed-time” eljárással végrehajtható, ez azonban mindenesetre a mérési időpontok meghatározott hőmérsékleti feltételek közötti nagyon pontos betartását igényli, ami kielégítő pontossággal csak analizáló automatáktól sikerül, a manuális kezelést viszont ez messzemenően kizáija. A kreatinnal vagy ammóniával ellentétben $z 1-metil-hidantoin („N-metil-hldantoln , „NMH ) nem természetes alkotórésze a szérumnak vagy vizeletnek: egy 1-metil-hidantoinon mint köztiterméken át menő kreatinin-meghatározási módszer úgy azt a jelentős előnyt nyújtaná, hogy ennél el lehetne tekinteni a vakérték-méréstől, feltéve hogy az 1-metilhidantoin enzimadkus átalakulása maga indikátorreakcióként alkalmazható, vagy adott esetben kapcsolt indikátorreakciók szintén nem szérumban vagy vizeletben természetes körülmények között jelentős koncentrációban előforduló anyagokon át futnak le. Szükség van tehát 1-metil-hidantoin enzimatikus analízisére szolgáló olyan eszközre és eljárásra, amely lehetővé teszi kvantitatív, előnyösen fotometriás mérését más szérum- vagy vizelet-alkotórészek egyidejű együttmérése nélkül. A feladatot a találmány szerint egy új, eddig nem ismert enzimmel oldottuk meg, amely 1-metil-hidantoint legalább egy nukleozid-trifoszfát, előnyösen adenozin-5 -trifoszfát (ATP), egy többértékű fémion, előnyösen magnézium(ll)- vagy mangán(II)-ion, valamint adott esetben valamilyen ammóniumsó jelenlétében hidrolizálni képes. Az irodalomban ugyan már leírták hjdantoinok különböző forrásokból származó „hidantoinázok - kai (hidropirimidin-hidroláz, E. C. 3.5.2.2.) végzett különféle enzimatikus hidrolíziseit, azonban hatást eddig csak szubsztituálatian hidantoinnal [Wallach, D. P. and S. Grisolia, J. Biol. Chem. 226, 277—288 (1957)] illetve 5-helyzetben szubsztituált hidantoinokkkal [26 31 048. sz. és 28 11 303 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratok; Olivieri, R., E. Fascetti, L. Angelini and L. Degen; Biotechnology and Bioengineering 23, 2173—2183 (1981)] szemben mutattak ki. Ezenkívül az illető enzimek egyikének esetében sem mutattak ki kofaktor-függőséget; a Wallach és munkatársai által leírt enzim hidantoin hidrolíziséhez például nem is igényli többértékű fémionok hozzáadását, Olivieri és munkatársai munkájában viszont ammónium-kloiid (0,1 mól/liter) jelenlétében a hidantoin-hidroláz jelentős gátlására utalnak, míg a találmány szerinti enzim aktivitása ammóniumsók hozzáadásával még jelentősen növelhető is. A találmány szerinti enzim előfordulását, elkülönítését és tulajdonságait valamint 1-metil-hidantoin illetve kreatinin meghatározására való alkalmazását a következőkben részletesebben leírjuk. A találmány szerinti új enzim, az 1-metil-hidantoináz mikroorganizmusokban széleskörűen előfordulónak látszik. így például megtalálták a Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus és Arthrobacter nemhez tartozó mikroorganizmusokban. Ezen nemekhez tartozó törzsekre, amelyekben a találmány szerinti enzim feldolgozásra érdemes mennyiségben megtalálható volt, példaként Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 vagy Brevibacterium spec. DSM 2843 említhető. A találmány szerinti enzim előnyösen úgy nyerhető, hogy az előbb felsorolt mikroorganizmusok valamelyikét tenyésztjük, és az enzimet a biomasszából vagy/és a tápközegből különítjük el. Az új enzim következő tulajdonságait határoztuk meg: 5 10 15 20 25 30 *5 40 45 50 55 60 2
