194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására

1

194 303

2

1. Molekulasúly:

SDS-gradiens gélelektroforézís. Ms

2. pH-Optimum: pH = 7,8.

Aktivitás %-ban 25°C-on.

125000.-<6,5

7,0

7,5

8,0

8,5 9,0

5

76

100

100

95 69

1

26

60

52

38 19

pH

TES-puffer 150 mmól/liter

TRIS-puffer 150 mmól/liter

3. Fajlagosság:

Relatív aktivitás %-ban (ADP)plruvát-kináz(laktát-dehidrogenázon át).

a) Szubsztrát (mindenkor 0,1 mmól/liter végkoncentráció a reakcióelegyben)

A szubsztrátfajlagosság meghatározása céljából a következőképp jártunk el:

1. Alapreagens komponensek koncentráció kálium-foszfát (pH 8,0)

NADH ATP

foszfo-enol-piruvát magnézium-klorid piruvát-kináz laktát-dehidrogenáz

2. 1-Metil-hidantoináz (15 rin, 20 mmól/liter TRIS

3. Hidantoin oldatok A hidantoin (1-metil-hidantoin, hidantoin, 5-metil-hidantoin valamint 5,5-dimetil-hidarttoin) koncentrációja : mindig 0,6 mmól/liter víz.

4. A vizsgálat kivitelezése

Hullámhossz 365 nm : T = 25°C : d = 1 cm : térfogat 1,21 ml.

A küvettákba pipettázandók Minta

75 mmól/liter 0,25 mmól/liter 1,30 mmól/liter 0,42 mmól/liter 2,00 mmól/liter 4 egység/ml 10 egység/ml. egység/ml 50%-os glice- HC1 pufferben, pH 8,0).

Alapreagens (1) Minta (3)

Viz

1,00 ml 0,20 ml

Reakcióelegy

vakérték

1,00 ml 0,20 ml

összekeverni, azután hozzáadni

1-metil-hidantoi- 0,01 ml 0,01 ml

náz (2)

A minta AE-értékét (AEw) és a reakcióelegy — vakérték AE-értékét (AEy) az 1-metil-hidantoináz hozzáadása után 2 percen belül mérni.

AE = AEM - AEy

S. A relatív reakciósebesség számítása a különböző hldantoinokkal meghatározott AE/percből AE/perc (1-metil-hidantoin) = 100%-ra.

A következő eredményeket kaptuk:

1-metil-hidantoin 100%,

5-metil-hidantoin 14%,

hidantoin 13%,

5,5-dimetil-hidantoin 0%.

b) Nukleotidok.

Relatív aktivitás %-ban (ATP « 100) karbamoilszarkozin-amido-hidroláz + szarkozin-oxidázon át

való meghatározáskor:

Nukleotid (4 mmól/liter)

:

ATP

100

ADP

1

AMP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

GTP

7

CTP

1,5

TTP

0

UTP

0

PPi

0

Karbamoü-foszfát

0

Nátrium-tripolifoszfát

0

Nátrium-hexametafoszfát

0

Fémion-függőség

Relatív aktivitás %-ban (5 mmól/liter magnéziumklorid = 100).

mmól/liter anyag

%

0 magnézium-klorid

17

1

83

5

100

10

98

5 mangán-klorid

60

5 cink-klorid

24

Aktivátorok

Kifejezve NH«. Relatív aktivitás %-ban (30 mmól/

/liter ammónium-szulfát = 100).

Aktivátor anyag

mmól/liter

%

Semmi

0

44

Ammónium-szulfát

30

100

Ammónium-szulfát

10

95

Ammónium-klorid

30

91

Ammónium-acetát

30

98

Litium-szulfát

30

40

Nátrium-szulfát

30

39

Kálium-szulfát

30

59

Nátrium-klorid

30

41

Nátrium-hidrogén-karbonát

30

40

Inhibitorok

Kifejezve EDTA, NaF.

Nátrium-fluorid: 1 x 10’2

mól/liter 100%-ra gátol.

EDTA-gátlás* mmól/liter

relatív

aktivitás %

0

100

5

100

10

42

50

2

* A reakcióelegyben 7,5 mmól magnéziumfll)-ion jelenlétében.

7. Michaelis konstansok.

K^ATP (TES 0,15 mmól/liter, pH 7,8 : szarkozinraj: 0,8 mmól/liter:

K 1-metil-hidantoin (0,15 mmól/liter TES, pH 7,8, ADP-re) : 0,02 mmól/liter,

8. Stabilitás

a) hőstabilitás: 50%-os glicerinben:

20 mmól/liter TRIS, pH 8,0 (2 egység/ml).

30 perc

maradék aktivitás %-ban

25°C

100

50°C

94

60°C

70

70°C _

0

b) pH-stabilitás.

20%-os glicerin, 10 mmól/liter TRIS, 0,2 egység/ ml, + 4 C, 3 napig sötétben tárolva (kiindulás = 100%).

pH maradék aktivitás %-ban

6,3 8

6,5 20

7.0 61

8.0 72

9.0 86

3