193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
3. ) A reakciósebességek viszonylag nagyok. 4. ) A tőke költségek alacsonyabbak, mint a fermentációs folyamatoknál. 5. ) A technológia általános, mivel a transzaminázok különböző szelektivitásokkal állnak rendelkezésre, pl. aromás aminosav transzamináz, elágazó szénláncú aminosav transzamináz, savas oldalláncokkal rendelkező aminosavakra fajlagos transzaminázok, stb. Ilyen transzaminázok állíthatók elő pl. a következő mikroorganizmusokból: Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Achromobacter eurydice, Klebsiella aerogenes, és hasonlók. A jelen találmány gyakorlatában használatos transzaminázokat Umbarger, H.E. írta le (Annual. Rev. Biochem.), 47. kötet, 533—606 oldal (1978)). Ennek az általános módszernek az egyetlen legnagyobb hátránya az, hogy a fentebb leírt transzaminálási reakcióhoz az egyensúlyi állandó kb. 1,0. Ennek eredményeképpen a kívánt aminosav kitermelése a leírt reakcióhoz sohasem haladja mega kb. 50%-ot. Egy iparilag sikeres transzaminálási folyamat fejlődésének kulcsa a B 2-ketosavnak a kívánt B L-aminosavvá való nem teljes konverziója problémájának kiküszöbölése. A jelen találmány ezt a problémát úgy oldja meg, hogy aminodonorként L-aszparaginsavat használ (A L-aminosav), és a mellékterméket (A 2-keto-sav), azaz az oxálacetátot egy irreverzibilis reakció, a dekarboxilezés útján átalakítja piroszőlősavvá. Az oxálacetát irreverzibilis dekarboxilezése előnyösen kapcsolódik a transzaminálási reakcióhoz. így a transzaminálási reakciót ez a teljesség hajtja előre, amint ez a 2. reakcióból látható. Az oxálecetsav dekarboxilezése kapcsolódik a transzaminálási reakcióval találmányunk szerint, így az L-aminosavak előállításában nagy kitermelés érhető el ezzel a biokatalízises módszerrel. Ezt a módszert alkalmazva a B 2 - keto-sav prekurzor átalakulásában kívánt B L-aminosavvá megközelítőleg 100%-os kitermelés érhető el. Az oxálecetsav dekarboxilezését oxálecetsav dekarboxiláz (OAD) enzim (E.C.4.1,1.3) segítségével enzimesen lehet katalizálni. Bármilyen forrásból származó oxálacetát dekarboxilázt lehet használni. A jelen találmány gyakorlata szerint használható oxálecetsav•dekarboxiláz forrásokra példák: Micrococcus luteus (amely a Micrococcus lysodeicticus új neve ((lásd Methods in Enzymology, 1, 753—7 (1955)), amelyet az itt leírtak szerint alkalmazunk; Pseudomonas putida (lásd Biochem. Biophys. Acta 89, 381—3 (1964)), amelyét az itt leírtak szerint alkalmazunk; és Azotobacter vinelandii (lásd. J. Biol. Chem. 180, 13 (1949)), amelyet az itt leírtak szerint alkalmazunk, stb. Ezen kívül bármilyen más enzimet is használhatunk, amelynek van oxál-3 ecetsav dekarboxiláz aktivitása, ha általában nem is tekintik ezeket „oxálecetsav dekarboxiláz“-nak, ilyenek pl. a piruvát kináz, az aimasav-enzim, stb. Az oxálecetsav dekarboxiláz aktivitását fém-ionok hozzáadásával növelni lehet, ilyen fém-ionok pl. az Mn++, Cd++, C,o++, Mg++, Ni++, Zn++, Fe++, Ca++ és hasonlók. A jelen találmány szerinti módszert tehát az L-aminosavak széles választékának előállításához lehet használni a megfelelő 2-ketosav prekurzor és az ezt L-aszparaginsavval transzaminálni képes enzim megválasztásával. így pl. a fenil-alanin aminosavat, amely az aszpartám nevű édesítőszer gyártásában kulcsvegyület, ezzel az eljárással nagy kitermeléssel lehet előállítani fenil-piruvátból és L-aszparaginsavból, E. coli-ból izolált transzaminázt és/vagy Pseudomonas putidából, vagy Micrococcus luteusból izolált oxálecetsav dekarboxilázt alkalmazva. Hasonlóképpen, ugyanezeket az enzimeket alkalmazva, a p-hidroxi-fenil-piruvátot át lehet alakítani L-tirozinná; az indol-3-piruvátot vagy 3-(3-indolil)-piroszőlősavat át lehet alakítani L-triptofánná; a 2-oxo-4-metil-pentánsavat és lehet alakítani L-leucinná; és a 4-fenil-2-oxobutánsavat át lehet alakítani L-4-fenil-2-amino-butánsavvá. Különböző fa j— lagosságú transzaminázokat használva a 2- -oxo-3-metil-pentánsavat L-izoleucínná; a 2- -oxo-3-metil-butánsavat L-valinná; piroszőlősavat L-alaninná, 3-hidroxi-piruvátot L-szerinné, és 2-oxo-4-tiometil-butánsavat L-metioninná lehet transzaminálni. Az RCOCOOH ketosav kiindulási anyagban az R jelentése adott esetben fenil-, hitiroxi-fenil-, indolil-, hidroxil- vagy (1—4 szénatomos alkil)-tio-csoporttal helyettesített 1—6 szénatomos egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport. A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmas R csoportokra példák lehetnek a következők: metil-, izopropil-, izobuti 1-, szek-buti 1 -, benzil-, (metil-tio)-etil-, hidroxi-metil-, p-hidroxi-benzii-, butil-, 3-índoliI-metiI-csoportok. Az oxálacetát dekarboxilezésének mellékterméke, a piroszőlősav, értékes kereskedelmi termék, és a termelési folyamatból bármilyen eddig ismert és leírt módszerrel kinyerhető, pl. savasítással és desztillálással, ioncserével, oldószeres extrakcióval. Az enzimeket a reakciókeverékhez hozzáadhatjuk egész sejt, nyers sejt-üzátum (részlegesen tisztított enzim) vagy tisztított enzim formájában. Előnyösen tisztított enzimeket használunk vagy immobilizált formában vagy oldatban, mivel a konverziós sebesség enzim-egységenként így magasabb. Az enzimeket bármely, a szakterületen jártás szakember számára jól ismert technikával tisztíthatjuk. Micrococcus luteusból és Pseudomonas putidából származó oxálacetát dekarboxiláz tisztítására példákat írtak le Herbert (Methods in Enzimology 1,753—57 4 3 193902 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
