193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
5 193902 (1955)) és Morton és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 89, 381—83 (1964)). Az enzimeket alkalmazhatjuk oldatban vagy immobilízált enzimként, ahogy korábban említettük, a jelen találmány gyakorlati kivitelében. Az immobilízált enzimrendszerre Weetall és munkatársai adtak példát (Methods in Enzimology 34, 59—72 (1974)), amelyet itt irodalmi hivatkozásként be is építünk. Weetall és munkatársai szabályozott pórusméretü üvegágyon (Corning) glutáraldehiddet aktivált immobilízált enzimhez írtak le módszert. Ezzel a módszerrel összhangban a transzaminázt az üvegrészecskékhez kötjük, az enzimet az aktivált üvegrészecskékkel 0—5°C hőmérsékleten 2 órán át reagáltatva pH 7,0 értékű foszfát pufferban. A kapcsolt enzimet használhatjuk közvetlenül, vagy először reagáltathatjuk 1%-os nátríum-bórhidriddel, hogy stabilizáljuk, az enzim és az aktivált üveg közti kovalens kötést. Más alkalmas szubsztrátumok az enzimek immobilizálására a jelen találmány gyakorlata szerint magukban foglalják a pórusos kerámiát, szefarózt, dietil-amino-etil cellulózt, és hasonlókat. Ezek az anyagok, ha szükséges, a szakterületen jól ismert módszerekkel aktiválhatok. Az oxálecetsav dekarboxilázt vagy külön immobilizáljuk, vagy először összekeverjük a transzaminázzal és a keveréket együtt immobilizáljuk. Az üvegágyakat, amelyekhez az enzimeket kovalensen hozzákötöttük a korábban leírt módszer szerint, a következő oldatban szuszpendáljuk: 10 mmól/liter fenii-piruvát, 10 mmól/liter L-aszparaginsav, l mmól/liter MgCI2 vagy MnSÖ4, pH 4,0 és 10,0 között, legelőnyösebben 5,5—8,5 között beállítva. Amikor az összes fenil-piruvát elfogyott, az oldatot az üveg-ágytól leszűrjük az L-fenilalanint és piroszőlősavat hagyományos módszerekkel izoláljuk és tisztítjuk. Az L-aszparaginsav reakcióját L-aminosavak és piroszőlősav előállítására követni lehet, ha szükséges. Egy általános mérési módszer, amely alkalmazható minden L-aszparaginsavat, mint amino-donort alkalmazó transzaminálási reakció vizsgálatához, tekintet nélkül arra, hogy milyen 2-ketosav prekurzort használunk, a következő: L-aszparaginsavat, egy 2-ketosavat,‘ transzaminázt, NADH-t, és almasav dehidrogenázt (kereskedelemben kapható) feloldunk 6,0 és 9,0 közötti pH értékű foszfát pufferban; a változást 340 nm-es abszorpciónál (A340) az idő függvényében mérjük. Ez a változás az abszorpcióban 340 nm-nél megfelel a NADH fogyasztásnak az oxálecetsav redukciója során, amely oxálecetsav az L-aszpartátból képződik a transzaminálási reakció során. Egy másik módszer szerint pl. a fenilpiruvát átalakulását L-fenilalaninná kényelmesen lehet vizsgálni, alikvotokat véve a reakciókeverékből — amely pl. transzaminázt, íenil-piruvátot, L-aszpartátot, oxálacetát de- 4 karboxilázt és fém-ionokat tartalmaz —, 2,5%-os vizes nátrium-hidroxid oldattal (tömeg/térfogat) hígítva, és az abszorpciót 320 nm-nél mérve. A hígítás a nátrium-hidroxiddal a fenil-piruvát keto- és enol formái közti egyensúly gyors elérését okozza. Az extinkciós együttható 320 nm-nél az egyensúlyi keverékhez 17 500 mór'cm-1. így a fenil-piruvát átalakulását L-fenilalaninná gyorsan és kvantitatíven lehet mérni. Ezt a vizsgálatot alátámaszthatjuk az L-fenilalanin kvalitatív mérésével papírkromatográfiával és kvantitatív mérésével, aminosav analizátort alkalmazva. Hasonló technikákat alkalmazhatunk más 2-keto-savaknak a megfelelő L-aminosavakká történő átalakításához, alkalmas mérésekhez. A p-hidroxi-fenil-piruvát transzaminálását L-tirozinná úgy lehet követni, hogy a reakciókeverékből kivett alikvotokat 2,5%-os NaOH oldattal hígítunk, az abszorpciót 331 nm-nél mérjük (extinkciós együttható 19 900 mór'cm-1), és hasonlóképpen követhetjük az indol-3-piruvát átalakulását L-triptofánná, az abszorbciót 328 nm-nél mérve (extinkciós együttható 10 000 mór'cm-1). A találmányt az ez után következő példák részletesebben ismertetik, ezek a példák csak bemutató jellegűek és nem az a céljuk, hogy á találmány oltalmi körét korlátozzák. 1. példa Aromás sav transzamináz előállítása L-tápközegen fenntartott E. coli K—12 törzzsel inokulálunk egy 2 literes rázólombikban található 500 ml tápközeget, amelynek összetétele a következő: 6 kh2po4 5 g/liter k2hpo4 5,56 g/liter (NH4)2SO '4 2 g/liter MgS04 75 mg/liter Na3citrát.2H20 1 g/liter *Nyomelem-oldat 3 ml/liter Glükóz 10 g/liter * A nyomelem-oldatot a következőképpen készítjük: Fémsó Mennyiség Végső koncentráció FeCl3.6H20 27 g/1 300 pmól ZnCl2 1.3 g/1 30 pmól CoCI.2.6H20 2 g/1 25 pmól Na2Mo04. ,2H20 2 g/1 25 pmól C.aCl2.2H20 1 g/1 20 pmól C.uCl2.2H2Ö 1.27 g/1 22 pmól h3bo3 0,5 g/1 24 pmóí HC1 (koncentrált) 100 ml/1 3,6 pmól A növesztést 37°C hőmérsékleten 15 órán át végezzük. Ezeket a lombikokat használjuk a 14 literes Biolafitte gyártmányú fermentorok inokulálásához (1 literes rázólombik-tenyészetet 7 literbe), amely fermentorok 7 liter alábbi összetételű tápközeget tartalmaznak: KH2P04 2,0 g/liter K2HP04 3,6 g/liter 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
