193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
1 A találmány tárgya alía-aminosavak előállítása, ezen belül elsősorban az L-aminosavak előállítása transzaminálással L-aszparaginsav és a kívánt aminosavnak megfelelő alfa-ketosav között. Az aminosavakat az utóbbi időkben állati takarmányokhoz adalékanyagként, emberi élelmezéshez táplálkozás-kiegészítőként, valamint gyógyszerekhez és mezőgazdasági alkalmazású vegyszerekhez szintetikus köztes anyagként alkalmazzák. Az L-glutaminsavat alkalmazzák íz-erősítőként az élelmiszerekhez évi 1 billió dollár fölötti értékben a világpiacon. A metionin az állati takarmányok nagy volumenű adalékanyagai, és az L-triptofán és L-treonin potenciálisan hasonló alkalmazása várható. Az L-fenilalaninnak és L-aszparaginsavnak nagyon fontos piaca van, mint kulcs-komponensnek az aszpartám édesítőszer gyártásában. Az infúziós oldatok egy sor aminosavat igényelnek, beleértve olyanokat is, amelyek esszenciálisak az emberi étrendben. A jelenlegi aminosav-előállításhoz használt módszerek között találjuk az extrakciót, a kémiai szintézist, amelyet rezolválás követ, a fermentációt és az enzimes szintézist (biokatalízist). Az aminosavak L-formája szükséges a legtöbb alkalmazási területen, de bizonyos aminosavak sokkal könnyebben állíthatók elő a racém D, L formában, mint az L-formában. Az extrakciós eljárás a szóban forgó aminosav terjedelmes tisztítását igényli a fehérje-hidrolizátumokból. Kémiai szintézises módszerekkel általában racém keverék képződik, és a rezolválási eljárás optikailag aktív termékek előállításához gyakran költségesés nem hatékony. A fermentáció, bár leküzdi a korábban említett módszerekhez tartozó hátrányok legtöbbjét, a konverzió kis arányának, a híg oldatoknak, költséges tisztítási eljárásoknak és nagyon magas tőkeberuházásnak problémáit veti fel. A biokatalízis viszont lehetőséget nyújt a kisebb gyártási költségekhez a legtöbb esetben, a jelentősen csökkent tőkeigények, a termelési folyamatban a melléktermékek távolléte következtében a kisebb tisztítási költségek, és a szubsztrátumok nagyobb konverziós hányada következtében; a nagyobb konvérziós hányad a szubsztrátumtól a termékig a folyamatban érdekelt kevesebb enzimatikus lépés eredménye. Néhány biokatalitikus folyamat jelenleg is használatban van. így pl. L-aszparaginsavat kereskedelmi méretekben is gyártanak fumársav és ammónia reakciójával aszpartáz enzim jelenlétében. (Lásd Tosa és munkatársai: Appl. Microbiol. 27, 886—9 (1977)). Az L-fenilalanint is elő lehet állítani enzimes szintézissel fahéjsavból és ammóniából, fenilalanin-ammónia Ház enzimet használva. Az L-alanint L-aszparaginsavból lehet szintetizálni enzimes dekarboxilezéssel (lásd 3, 458, 400 és 3,463, 704 számú amerikai egye- 2 2 sült államokbeli szabadalmi leírások). Ezek a folyamatok alkalmasak a felsorolt egyes aminosavak előállításához. Ezeknek a folyamatoknak egyike sem alapszik azonban egy olyan általános enzimes technológián, amely széles körben alkalmazható lenne több aminosav előállításához. Az enzimes folyamatok egyike, amely széles körben alkalmazható több aminosav előállításához, a 3,183,170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található. A 3,183,170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerinti folyamatban L-glutaminsavat és egy ketosavat hoznak össze transzaminázzal, alfa-keto-glutársavat és L-amino-savat állítva elő. Az alfa-keto-glutársav folyamatosan redukálódik L-glutaminsavvá egy több-komponensű enzim-rendszer, hidrogén-gáz és nitrogén-forrás — mint pl. szervetlen ammónium-só, szerves ammónium-só, ammónium-hiroxid, ammónia-gáz vagy karbamid — jelenlétében. Az így termelt L-glutaminsav visszatér a gyártási ciklusba, így lehetségessé válik nagy mennyiségű L-aminosav előállítása kis mennyiségű L-glutaminsavval. Ez a több-komponensű enzim-rendszer azonban nehezen működik ipari méretekben, mivel az NAD/NADH kofaktort igényel, amely drága, hidrolitikusan labilis, valamint oxigénre és fényre érzékeny. Röviden összefoglalva a jelen találmány tárgya olyan enzimes eljárás, amely több alfa-aminosav előállítására képes a készen rendelkezésre álló L-aszparaginsavból (vagy aszpartázból). A jelen találmány szerinti eljárásban az L-aszparaginsavat és valamely alfa-keto-savat reagáltatunk transzamináz jelenlétében L-aminosavat és oxálacetátot képezve, ezt követi az említett oxálacetát dekarboxilezése piroszőlősavvá. Az oxálacetát dekarboxílezése hajtja a reakciót a teljesség felé. A kívánt L-aminosav 95 vagy több %-os kitermelését könnyen elérhetjük. A mellékterméket, a piroszőlősavat könnyen el lehet különíteni az L-aminosavtól és ez nagyon jól eladható. Az alábbiakban a találmány szerinti eljárást részletesen ismertetjük. A jelen találmánnyal összhangban az enzimeknek a transzaminázokként (aminotranszferázokként) ismert osztálya az 1. reakció szerinti folyamatot katalizálja. A megfelelő B 2.-keto sav prekurzort kiválasztva, egy kívánt B L-aminosavat lehet előállítani transzaminálással, egy másik A L-aminosavat használva amino-donorként. A reakció melléktermékeként egy A második 2-keto-savat is állítunk elő a kívánt B L-aminosav mellett. A transzaminálási technológia előnyei: 1. ) Az L-aminosavat fajlagosan állítjuk elő. 2. ) A 2-ketosav prekurzorok kényelmesen előállíthatok kémiai szintézissel. 193902 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
