193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 egy része azonban az általunk használható mRNS-nek. Az mRNS további tisztítása érdekében felhasználjuk azt a tényt, hogy a magasabbrendű szervezetek sejtjeiben az mRNS a transzkripciós lépés után további reakciókban vesz részt, nevezetesen poliadenilsavhoz kötődik. Az ilyen poliadenilsavat tartalmazó mRNS cellulóz-oligo-timi-dilát kromatografáló oszlopon elkülöníthető (Aviv és Leder, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69, 1408, 1972). A fentiek értelmében kivitelezett tisztítás elegendően tiszta, intakt"és más sejtbe átvihető mRNS-t biztosít ribonukleáz enzimben gazdag kiindulási anyagból. Az mRNS fentiekben kivitelezett tisztítását és az azt követő in vitro eljárást lényegében hasonló módon végezhetjük bármely organizmusból nyert mRNS esetén is. Bizonyos körülmények között, például akkor, ha az mRNS forrása szövettenyészet sejtje, a ribonukleáz szennyeződés olyan alacsony lehet, hogy a megadott ribonukleáz-gátlást biztosító módszert nem kell alkalmaznunk. Ilyen esetekben elegendő lehet az irodalomban már ismert ribonukleáz-aktivitást csökkentő módszerek használata. 3. A cDNS előkészítése Ezen lépés elején elkészítjük a tisztított mRNS-val komplementer DNS-t. A reakciót a reverz transzkriptázzal végezzük, bár használhatunk bármely olyan enzimet, amely képes az mRNS templátból megfelelő komplementer DNS láncot kialakítani. A reakciót végezhetjük az irodalomból már ismert körülmények között, nevezetesen mRNS templát és mint a DNS molekula prekurzorai, a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében. Előnyös, ha az egyik dezoxi-nukleozid-trifoszfátot az a-helyzetű foszfornál izotóppal jelöljük (32 p), ily módon követhetjük a reakciót, az elkülönítési eljárás, például a kromatográfia vagy az elektroforézis után vizsgálhatjuk a terméket, továbbá mennyiségi szempontból becsülhetjük a vegyület visszanyerését (Efstratiadis, Kafatos, Maxam és Maniatis, Cell, 7, 279, 1976). Ahogy azt az 1. ábrán látjuk, a reverz transzkriptáz enzimmel katalizált reakció terméke egy kétszálú, hajtűhöz hasonló alakú molekula, ahol az RNS és a DNS szálak között nem-kovalens kötések létesültek. A reverz transzkriptáz enzimmel végzett reakció termékét az irodalomban ismert módszerekkel különítjük el a reakcióelegyből. Használhatjuk a fenolos extrakciót, de izolálható a termék a Sephadex G-10 gyantával (Pharmacia Inc., Uppsala, Svédország) végzett kromatográfiával vagy etanolos kicsapással, vagy ezen módszerek kombinációjával. Amikor a cDNS-t enzimatikus szintézissel előállítottuk, az RNS templátot eltávolíthatjuk. Az irdalomban több módszer ismeretes az RNS bontására DNS jelenlétében. Előnyös módszer az alkálikus hidrolízis, amely 13 8 igen szelektív és a reakcióelegy pH-jának beállításával könnyen szabályozható. Az alkálikus hidrolízis után semlegesítjük a reakcióelegyet, majd a P32-jelzett cDNS-t adott esetben etanolos kicsapással töményítjük. A kétszálú, hajtű alakú cDNS szintézisét megfelelő enzimmel, mint például DNS-polimerázzal vagy reverz transz-kriptázzal katalizált reakcióval végezzük. A reakciót az előző reakció kapcsán megadottak szerint végezzük, beleértve az a-P -jelzett nukleozid-trifoszfát használatát is. A reverz transzkriptáz enzimet több helyről izolálhatjuk. A legelőnyösebb enzimforrás a madarak mieloblasztózis vírusa. A vírust dr. Beard-tól kaptuk (Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, Egyesült Államok), aki a vírust a National Institutes of Health felügyelete alatt állította elő. A cDNS előállítása után előnyösen elkülönítjük azt a reakcióelegyből. Ahogy azt az előbbiekben ismertettük, az izolálást fenolos extrakcióval. Sephadex G—100 gyantával készült oszlopon kivitelezett kromatográfiával vagy etanolos kicsapással végezzük. Az így kapott DNS nem tartalmaz szennyező fehérjét. Az így előállított DNS hajtű-szerű szerkezete átalakítható az ismert kétszálú szerkezetté oly módon, hogy eltávolítjuk a molekuláról a komplementer szálak végeit összekötő egyszálú hurkot. A DNS kétszálú szakaszainak specifikus hidrolízisét végző enzimek nagy száma ismert, és ezek könnyen beszerezhetők. Előnyösen az Aspergillus oryzaeből izolált SÍ nukleázt használjuk. Az enzim megvásárolható a következő cégtől: Miles Research Products, Elkhart, Indiana, Egyesült Államok. Ha a hajtű alakú DNS molekulát az SÍ nukleázzal kezeljük, úgy jó kitermeléssel olyan cDNS molekulákat kapunk, amelyek végein bázispárok vannak. Ezután az előzőekben megadottak szerint extrakciót, kromatográfiát és etanolos kicsapást végzünk. A reverz transzkriptáz és az SÍ nukleáz használatát az mRNS templátról leírt kétszálú cDNS szintézisekor Efstratiadis és munkatársai ismertetik (Cell, 7, 279, 1976). Adott esetben növelhetjük azoknak a cDNS molekuláknak a számát, amelyek végei bázispárokból állnak, oly módon, hogy a molekulát a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében E. coli-ból származó DNS-polimeráz I enzimmel kezeljük. Az enzim exonukleáz és polimeráz aktivitása oly módon hat, hogy eltávolítja a molekula 3’-végéről a kinyúló egyszálú végeket, és ugyanakkor hozzászintetizálja az 5’-végeken lévő egyszálú részekhez a megfelelő bázispárokat. Ily módon biztosítjuk a cDNS-molekulák maximális részvételét a következő reakciókban. Az eljárás következő lépésében a cDNS termékben lévő molekulák végeit kezeljük, amiután olyan molekulákat kapunk, amelyeket 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
