193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
a restrikciós endonukleázok felismernek. Azt, hogy milyen DNS fragmenset kapcsolunk a molekulához, az szabja meg, hogy milyen manipulációs eszközök állnak rendelkezésünkre. A molekulához kapcsolt bázis-szekven ciát azon az alapon választjuk ki, hogy milyen specifikus restrikciós endonukleázt kívánunk használni, ugyanakkor a választás attól is függ, hogy milyen a cDNS-vel rekombinált DNS vektormolekula. A kiválasztott plazmidnak olyannak kell lennie, hogy legalább egy olyan hellyel rendelkezzék, ami érzékeny a restrikciós endonukleázra. így pl. a pMB9 plazmid egy restrikciós helyet tartalmaz a Hind III enzimre. A Hind III enzimet a Hemophilus influenzae-ből izoláljuk, és Smith és Wilcox módszerével (J. Mól. Bioi., 51, 379, 1970) tisztítjuk. A Hae III jelű enzimet a Hemophilus aegypticus mikroorganizmusból állítjuk elő és Middleton, Edgell és Hutchison módszerével (J. Virol., 10, 42, 1972) tisztítjuk. A Hemophilus s.uis mikroorganizmusból izolált Hau I jelű enzim hasonló helyekre specifikus hidrolízist katalizál, mint a Hind III enzim. Ezt a két enzimet ezért funkcionálisan kicserélhetőnek tekintjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint olyan kémiailag szintetizált kétszálú dekanukleotidot kapcsolunk a cDNS duplexhez, amely a Hind III enzimre érzékeny szekvenciát tartalmaz. A kétszálú dekanukleotid bázis-sorrendjét az 1. ábrán mutatjuk be (Heynekker és munkatársai, Nature, 263, 748, 1976 és Scheller és munkatársai, Science, 196, 177, 1977). Az irodalomban több ilyen szintetikus, a restrikciós enzimet által felismert bázis-sorrend ismeretes, így előállíthatunk többféle olyan, a kétszálú DNS végeihez kötött egyszálú DNS-t, amely egy sor restrikciós endonukleáz hatására érzékeny. A cDNS végeihez kapcsolt és a restrikciós enzimekre érzékeny molekularészt az irodalomban ismert módszerekkel köthetjük. A találmány szerinti eljárás során az úgynevezett „sérült végű“ ligációs reakciót végezzük, amelyet a Panet és munkatársai által kidolgozott módszer (Biochemistry, 12, 5045, 1973) szerint tisztított DNS-ligáz enzim katalizál. Ezt a reakciót Sgaramella és munkatársai írták le (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 67, 1468, 1970). Ennek az úgynevezett „sérült végű“ ligációs reakciónak a terméke, amely reakció kettős szálú végekkel rendelkező cDNS molekulák és a nagy feleslegben jelenlévő kétszálú, a Hind III endonukleázra érzékeny bázis-sorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleotid között megy végbe, egy olyan cDNS, amely mindkét végén tartalmazza a Hind III restrikciós helyeket. Ha a reakció termékét a Hind III endonukteázzal reagáltatjuk, olyan, az I. ábrán bemutatott molekulát kapunk, amely a restrikciós helyek hasadása következményeképpen. az 5’-végeken egyszálú önmagával komplementer részeket tartalmaz. 15 4. A rekombináns DNS tarnszfer vektor előállítása Nagyszámú vírus vagy plazmid DNS használható a fentiekben megadott módon előállított cDNS molekulával való rekombináns képzésére. Az alapvető követelmény az, hogy az átvihető DNS molekula képes legyen belépni a gazdasejtbe, ott replikálódj^n, ezenfelül hordoznia kell olyan genetikailag meghatározott tulajdonságot, amely lehetővé teszi, hogy kiválasszuk azokat a gazdasejteket, amelyekbe ez a DNS molekula belépett. A közbiztonság miatt azonban csak olyan átvihető DNS molekulát válaszhatunk, amely az Egyesült Államok National Institutes of Health követelményeinek megfelel (lásd előbb). Az ítvihető DNS molekulák listája állandóan lő, ahogy új molekulákat fedeznek fel, ámeneket a National Institute of Health Recombinent DNS Safety Committee elfogad. A jelenleg alkalmazott előnyös átvihető molekulák között nagyszámban szerepelnek a X-bakteriofágból származók (Blatter, Williams, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Grunwald, Kiefer, Moore, Schumm, Sheldon és Smithies, Science, 196, 161, 1977), továbbá a col El plaznidból származók (például Rodriguez, Bolivar, Coodman, Boyer, Betlach, ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression; Ed,: Nierlich, Futter és Fox: Academic Press, N.Y., 1976. 471—477. oldal). A col El-ből származó plazmidokra az jellemző, hogy viszonylag kicsik, molekulasílyúk néhány millió, és azzal a különleges tulajdonsággal rendelkeznek, hogy az egy sejtben jelenlévő plazmid DNS molekulák szán a a közönséges körülmények közötti 20— 40-ről a gazdasejt klóramfenikolos kezelésével 1000-re vagy többre növelhető. Megfelelő, a kísérletező szabályozásával kialakített körülmények között a gazdasejten belüli gének számának növelése lehetővé teszi, hogy a gazdasejt a plazmid génjei által kódolt elsődleges proteineket termelje. A col El ilyen származékai ezért előnyös átvihető DNS-ként jönnek számításba a találmány szerinti eljárásban. A col El előnyös származékai például a tetraciklin rezisztenciát okozó géneket hordozó pMB—9 plazmid, továbbá a pBR—313, pBR—315, pER—316, pBR—317 és pBR—322 plazmidok, amelyek a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát okozó géneken kívül tartalmazzák az ampicillin-rezisztencia génjeit is. A gyógyszerekkel szembeni rezisztenciát okozó gének jelenléte biztosítja azt az előnyt, hogy kivá'aszthatjuk a plazmiddal fertőzött sejteket, mivel az ilyen sejtekből kialakult telepek a gyógyszer jelenlétében nőnek, míg a plazmído‘ nem kapott sejtek nem nőnek, illetve nem fejlesztenek telepeket. A találmány szerinti eljárást szemléltető példákban olyan plazmidot használunk, amely a col El-ből szár16 9 19386C 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
