193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 29 30 3. táblázat (folytatás) Pro Arg Ile Gly Gin He Leu Lys Gin 140 Thr Tyr Asp Lys Phe Asp CCC CGT ATT GGG CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAT GAC AAG TTP GAC Alá Asn Met Arg Ser Asp Asp Al a Leu Leu Lys Asn Tyr Gly 160 Leu GCC AAC ATG CGG AGC GAT GAC GCT CTG CTC AAA AAC TAT GGG CTG Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu CTC ICC TGC TTC AAG AAG GAC CTG CAC AAG GCA GAG ACC TAC CTG Arg Val Met Lys 180 Gys Arg Arg Plie Ala Glu Ser Ser Cys Ala Phe CGG GTC ATG AAG TGT CGC CGC T”T GCG GAA AGC AGC TGT GCT TTC TAG GCACACACTGGTGTCTCGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACTCTGGCAAC TGCCACCCCCTACACTTTGTCCTAATAAAYTTAATGATGCATATC poli(A)--3' 6. példa Ismeretjük az emberi növekedési hormon aminosavait meghatározó teljes génkészlet izolálását és tisztítását, továbbá az emberi növekedési hormon teljes strukturális génkészletét tartalmazó rekombináns plazmid szintézisét és az emberi növekedési hormon teljes struktúrális génjét genetikai készletében tartalmazó mikroorganizmus előállítását. Az emberi növekedési hormon mRNS-ének izolálását lényegében az 5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a biológiai kiindulási anyag az ember hipofízis tumorszövete, öt jóindulatú emberi hipofízis tumort sebészeti eltávolítást követően folyékony nitrogénben gyorsan megfagyasztunk, majd a 0,4 g és 1,5 g közötti súlyú készítményt apró darabkákra vágjuk és 4 mólos, 1 mól merkaptoetanolt tartalmazó és 5,0 pH-jú guanidium-tiocianátban 4 C° hőmérsékleten homogenizáljuk. A homogenizátumot 1,2 ml 5,7 mólos, 100 mM EDTA-t tartalmazó céziumkorid fölé rétegezzük, majd 18 órán át percenként 37 000-et forduló SW 50,1 rotorban Beckman ultracentrifugában 15 C° hőmérsékleten centrifugáljuk. Az RNS a centrifugacső alsó részébe vándolol. További tisztításhoz oligo-dT oszlopot és szacharóz grádiens ülepítést használunk az 1., 2. és 3. példában megadottak szerint eljárva. Az így izolált RNS körülbelül 10%-a a növekedési hormont kólodja, amit a radioaktív aminosav prekurzornak búzamagból származó sejtementes transzlációs rendszerével végzett kísérlet során az antinövekedési hormon csapadékba való beépülésével bizonyítunk (Roberts és Patterson, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 70, 2330, 1973). Az emberi növekedési hormon cDNS-ének előállítását lényegében az 5. példában megadottak szerint végezzük. Az emberi növekedési hormon cDNS-ét gé- 2>5 lelektroforézissel frakcionáljuk, majd klonozáshoz elkülönítjük a körülbelül 800 nukleotidnak megfelelő helyre vándorló anyagot. Az elkülönített frakciót az 5. példában megadottak szerint eljárva DNS-polimeráz 30 1 enzimmel kezeljük, majd végéhez hozzákapcsoljuk a Hind III dekanukleotidot. Ezután a cDNS-t alkálikus foszfatázzal kezelt pBR—322 plazmiddal rekombináljuk DNS-ligázt használva. Az így előállított nuklein- 35 savat E. coli X—1776 törzsbe transzformáljuk, majd olyan telepeket izolálunk, amelyek tartalmazzák az emberi növekedési hormon DNS-t. Preparatív mennyiségben tenyészttük az emberi növekedési hormonjának DNS-ét tartalmazó törzset, majd az emberi növekedési hormon DNS-ét izoláljuk, és meghatározzuk nukleotid-sorrendjét. Ügy találtuk, hogy a klonozott emberi növekedési hormon DNS az emberi növeke- 45 dési hormon teljes aminosav-sorrendjét kódoló nukleotidokat tartalmazza. Az emberi növekedési hormon első 23 aminosav-sorrendje a következő: H2N—Phe-Pro-Thr-Ile-10 50 -Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-20-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu. A további aminosav-sorrendet a 4. táblázatban mutatjuk be. 55 4. táblázat Az emberi növekedési hormon DNS egy szálának nukleotid-sorrendje. A szekvenciágO ban megadott számok az amino-terminális aminosavtól számítva az emberi növekedési hormon megfelelő aminosavjainak számát adja meg. A DNS megadott bázis-sorrendje megfelelő az mRNS bázis-sorrendjének, azzal a különbséggel, hogy az mRNS-ben 65 T helyett U áll. 16
