193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 génjét tartalmazza, izutân a 3. példában megadottak szerint eljárva kémiailag szintetizált Hind III dekanukleotiddal reagáltatjuk. Ampicillin rezisztenciát okozó gént és a tetraciklin-rezisztencia génben egy Hind III támadóhelyet tartalmazó pBR—322 plazmidot a 4. példában megadottakat megismételve Hind III endonukleázal és alkálikus foszfatázzal kezeljük. Ezután a 3. példában megadottak szerint reagáltatjuk a DNS-ligáz jelenlétében a kezelt plazmidot és a 800 bázispárból álló, a jiatkány növekedési hormonját kódoló cDNS-t. Magában ebben a reakcióelegyben jutattjuk be a DNS-t a szuszpenzióként adagolt E. coli X—1776 sejtekbe, amiket a 3. példában megadottak szerint előkezeltünk. A rekombináns telepeket úgy szelektáljuk, hogy azokat a sejteket különítjük el, amelyek ampicillint tartalmazó tápközegeken nőni tudnak, 20 Mg/ml tetraciklin jelenlétében viszont nem képesek nőni. 10 ilyen telepet kapunk, mincfegyikük hordozza a 800 bázispárt tartalmazó plazmidot, amit a Hind III enzimmel kivitelezett hasítással teszünk szabaddá. A patkány növekedési hormonját leíró 800 bázispárt tartalmazó DNS-t preperatív menynyiségben a rekombináns pRGH—1 telepek-27 bői izoláljuk, és meghatározzuk nukleotid-sörrendjét. Ebben az esetben meghatároztuk az 5’-vég át nem másolt nukleotid-sorrendjét, továbbá a növekedési hormon szekréció előtt 5 prekurzor fehérjében lévő 26 aminosav sorrendjét is. A 3. táblázatban adjuk meg a meghatározott gén-szekvenciából konstruált mRNS bázis-sorrendjét. A jósolt ajninosav-sorrend az 1. és 8. hely kivételével jól egyezik 10 a patkány növekedési hormonjának részleges aminosav-sorrendjével, amit Wallis és Davies ad meg (Growth Hormone and Related Peptides, szerkesztő: Copecile és Müller: Else\ier, New York, 1976, 1 — 14. oldal) és amely 15 az I —43, 65—69, 108—113,133— 143 és 150— 190 (lásd a 3. táblázat) csoportokat tartalmazza). 3. táblázat 20 A patkány növekedési hormonját leiró DNS egy szálának teljes nukleotid-sorrendje. A megfelelő aminosavakat is megadjuk, az amino-terminális végtől kezdődő számozással. A negatív előjellel számozott aminosavak 25 a növekedési hormon előfehérjejének aminosav-sorrendjét jelzik. A megfelelő mRNS bázis-szekvenciája hasonló, azzal a különbséggel, hogy az mRNS-ban U helyett T áll. 28 5' GTGGACAGATCACTGAGTGGCG «« ^ ^ clo Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu Gys Leu Leu Trp Pro ACT CCC TGG CTC CTG ACC 1 Leu TTC AGC CTG CTC TGC CTG CTG TGG CCT Gla Glu Ala Gly Ala Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe CAA GAG GCT GGT GCT TTA CCT GCC ATG CCC TTG TCC AGT CUG TTT Alá Asn Ala Val Leu Arg Ala Gin Hi s Leu His Gin Leu Ala Ala GCC AAT GCT GTG CTC CGA GCC CAG CéC CTG CAC CAG CTG GCT GCT 40 Gin Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Al a Tyr Ile Pro Glu Gly GAC ACC TAG AAA GAG TTC GAG CGT GCC TAC ATT CCC GAG GGA CAG Arg Tyr Ser Ile Gin Asn Ala Gin Al a Ala Phe Cys Phe Ser Glu CGC TAT TCC ATT CAG 60 Pro AAT CCC CAG GCT CCT TTC TGC TTC TCA GAG Thr Ile Pro Ala Thr Gly Lys Glu Glu Ala Gin Gin Arg Thr ACC ATC CCA GCC CCC ACC GGC AAG GAG GAG 80 Leu CCC CAG GAG AGA ACT Asp Met Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Ile Gin Ser Trp GAC ATC GAA TTG CTT CGC TTC TGG CTG CTG CTC ATC CAG TCA TGG 100 Leu Gly Pro Val Gin Phe Leu Ser Arg Ile Phe Thr Asn Ser Leu CTG GGG CCC GTG CAG TTT CTC AGC AGG ATC TTT ACC AAC AGC CTG Met Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu ATG TTT GGT ACC TCG GAC CGC GTC TAT GAG AAA CTG AAG GAC CTG 120 Glu Glu Gly Ile Gin Ala Leu Met Gin Glu Leu Glu Asp Gly Ser GAA GAG GGC ATC CAG GCT TCG ATG CAG GAG CTG GAA GAC GGC AGC 15
