193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
majd 4 percen át 25 C°-on, végül 30 percen át 0 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Ezután a megfelelő szelekciós körülmények között agar-lemezekre széletsztjük a sejteket. A rekombináns plazmidok kutatására, azaz a Hind III szakasz transzformációjának kimutatására 5 pg/ml tetraciklint használunk. Ily módon egy pAU—1 jelű rekombinánst izolálunk. A pAU—1 rekombinánsból izolált 2 pg—5 pg DNS plazmid-készítmények emésztünk Hsu 1 endonukleáz fölöslegével. Ezután végkoncentrációra számolva 10 mM EDTA—Na2—t és 10% (súlyszázalék) szacharózt adunk a reakcióelegyhez, majd 8% poliakrilamid gélen szétválasztjuk az elegyek Az elektroforézises vizsgálat szerint a DNS a 410 bázispárnak megfelelő helyen található. A fenti kísérletet pBR—322 plazmiddal megismételjük. Minden a fentiekben megadottak szerint végzünk, kivéve a rekombináns telepek szelekcióját, amit 20 pg/ml ampicillint tartalmazó lemezeken végzünk. 5. példa Ismertetjük a patkány növekedési hormonjának megfelelő teljes strukturális gén-sorrendet tartalmazó DNS izolálását és tisztítását, továbbá a patkány növekedési hormonjának teljes strukturális génkészletét tartalmazó DNS szinézisét és a patkány növekedési hormonjának génjét génkészletének részeként tartalmazó mikroorganizmus törzs előállítását. Abban az esetben, ha az izolált gének nem emberi eredetűek, úgy az Egyesült Államokban érvényes biztonsági korlátozások nem kívánják meg a cDNS olyan nagyfokú tisztaságban való izolálását, mint amikor emberi eredetű cDNS-ekkel dolgozunk. Ily módon lehetséges az, hogy a patkány növekedési hormonjának strukturális génjét tartalmazó cDNS-t elektroforetikus úton különítjük el: az elkülönített DNS a patkány növekedési hormonjának ismert aminosav-szekvenciája szerint körülbelül 800 bázispárt tartalmaz. A patkány növekedési hormonját leíró mRNS forrásaként az American Type Culture Collection-ból beszerezhető GH—1 szubklónozott és tenyésztett patkány sejteket használjuk (Tashjian és munkatársai, Endochrinology, 82, 342, 1968). Ezekben a sejtekben közönséges körülmények között kivitelezett tenyésztéskor a növekedési hormont leíró mRNS az összes poli-A-t tartalmazó RNS-nek kicsinyrésze, 1—3 %-a. A növekedési hormonnak megfelelő mRNS mennyiségét azonban tiroid hormonok és glukokortikoidok szinergista hatásával oly módon növeltük, hogy az meghaladta a többi sejtben lévő mRNS mennyiségét. Az RNS izolálására szuszpenziós tenyészetben 5Æ108 sejtet növesztettünk, majd 4 nappal a sejtek összegyűjtése előtt 25 14 többek között 1 mM dexametason és 10 mM L-trijód-tironin adagolásával indukáltuk a növekedési hormon termelésére. A poliadenilezett RNS-t a tenyésztett sejtek citoplazmatikus membrán-frakciójából izoláltuk az irodalomban megadottak szerint eljárva (Martial, Baxter, Goodman és Seeburg, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 1816, 1977: és Bancroft, Wu és Zubay, Proc. Natl. Acad, Sei., USA, 70, 3646, 1973). Ezután az előzőekben az 1—3. példában megadoítak szerint eljárva tovább tisztítjuk az mRNS-t és kétszálú cDNS-t készítünk belőle. Gélelektroforézises frakcionálással egy gyenge, de jól elkülöníthető sávot kapunk a 800 bázispárnak megfelelő DNS-nek jelölt helyen. A teljes mRNS-ből kapott cDNS-t Hha 1 endonukleázzal kezeljük, amikor az elektroforézises elkülönítés után két DNS-nek megfelelő fragmenset kapunk, amely közelitőleg 320 nukleotidnak (A fragmens) és 240 nukleotidnak (B fragmens) felel meg. Meghatározzuk az A és B fragmensek nukleotid-sorrendjét, és a vizsgálatok szerint ezek valóban a patkány növekedési hormonjának megfelelő kódokat tartalmazzák, azaz megfelelnek az irodalomban megadott patkány növekedési hormon aminosav-szekvenciára vonatkozó adatoknak és a más ismert növekedési hormon szekvenciáknak (Wallis és Davies, Growth Hormone and Related Peptides; szerkesztő: Copecile és Müller, Elsevier, New York, 1976, 1 —14. oldal: továbbá Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (2) 120—121. oldal. National Biomedical Research Foundation, Washington, 1976). Abban az esetben, ha a 800 bázispárból álló kétszálú cDNS-t a megadott módon elektroforézissel izoláljuk, majd szintén a megadott módon Hha I endonukleázzal kezeljük, egy a nagyobb hasítási termékek között az A és B fragmenseknek megfelelő hosszúságú két fragmenst találunk. Mivel a körülbelül 800 bázispárból álló és a patkány növekedési hormonját leíró cDNS-t a restrikciós endonukleázzal nem tisztítottuk, kezelnünk kell a DNS-t a bázispárok nélküli egyszálú végek eltávolítására. Gyakorlatilag úgy járunk el, hogy a pár nélküli szálakat az elektroforetikus elkülönítés előtt távolítjuk el 25 pl 60 mM-os pH 7,5 trisz-hidrogénkloridot, 8 mM magnézíumkloridot, 10 mM ß-merkaptoetanolt, 1 mM ATP-t és egyenként 200 pM dATP-t, dTTP-t, dGTP-t és dCTP-t tartalmazó reakcióelegyben. A reakcióelegyhez 1 E E. coli DNS-polimeráz I-et adunk, majd 10 percen át 10 C° hőmérsékleten exonukleolitikusan eltávolítunk minden 3’-véget és szintetizáljuk az 5’-pár nélküli végek megfelelő párját. A DNS-polimeráz I beszerezhető a következő helyen: Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianpolis, Indiana, Egyesült Államok. a A körülbelül 800 bázispárból álló cDNS-t amely a patkány növekedési hormonjának 26 193866 5 10 15 20 25 3C 36 40 45 50 55 60 65
