193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 mennyiségű restrkciós endonukleázzkal (Hae III) kezeljük, és a fentiek szerint eljárva gélelektroforézissel vizsgáljuk. Mindkét terméket hasítja az endonukleáz, így a radioaktivitás alapján meghatározott gélelektroforézises képen két sáv látható. A sávok a kettős szálú cDNS hasadásából származó termékekből adódnak, amik lényegében hasonló hosszúságú hasított termék jelenlétére utalnak, mint amit az egyszálú cDNS hasítása után kapunk. 3. példa Ismertetjük a Hind III érzékeny bázissorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleotid (a továbbiakban HindlII dekanukleotid) hozzákapcsolását a 2. példa szerinti eljárással előállított és patkány Langerhans sejtekből izolált kétszálú cDNS egyszálú szakaszt nem tartalmazó végeihez. A 2. példa szerinti módon előállított kettős szálú reakciótermék'et 2 pg/ml és 5 pg/ml koncentrációhatárok között 30 E, 1200 E/ml aktivitású, a Miles Laboratoriestől (Elkhart, Indiana, Egyesült Államok) vásárolt SÍ nukleázzal kezeljük. A reakciót 0,03 mól pH 4,6 nátriumacetátot, 0,3 mól nátriumkloridot és 4,5 mM cinkkloridot tartalmazó reakcióelegyben végezzük. 30 percen át 22 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 15 percen át 10 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Az emésztés leállítására 0,1 mól (végkoncentráció) trisz-bázist, 25 mM EDTA-t és Ehrenstein módszere szerint (Methods in Enzymology, Colowick és Kaplan, 12A kötet, 588. oldal, 1967) előállított 40 pg/ml E. coli tRNS-t adunk a reakcióelegyhez. Fenollal extraháljuk az elegyet, majd Sephadex G—100 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluált cDNS—P32-t etanollal kicsapjuk az oldatból. Ezután jó kitermeléssel a kémiailag szintetizált dekanukleotidhoz való kapcsoláshoz szükséges, végükön bázispárokat tartalmazó cDNS molekulákat kapunk. A Hind III dekanukleotidok előállítására Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Itakura módszere szerint (Science, 196, 177, 1977) járunk el. A Hind III dekanukleotidok és a cDNS összekapcsolását 14 C°-on való inkubációval végezzük a következő reakcióelegyben: 66 mM trisz-hidrogénklorid, pH 7,6, 6,6 MM magnéziumklorid, l mM ÀTP, 10 mM ditio-treitol, 3 mM Hind III dekanukleotid (105 cpm/pmól) és 500 E/ml T4 DNS-ligáz. Az inkubációt egy órán át végezzük. Ezután a ligáz enzim inaktiválására 5 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Végkoncentrációra számolva a következő vegyüieteket adjük az elegyhez: 50 mM káliumklorid, 1 mM ß-merkaptoetanol és 0,1 mM EDTA. Ezután 2 órán át 37 C° hőmérsékleten 150 E/ml Hsu I vagy Hind III endonukleázzal emésztjük a terméket. A Hind III vagy a Hae III endonukleáz 23 beszerezhető az Egyesült Államokban: New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Az előállított terméket az 1. példában megadott módon gélelektroforézissel analizáljuk. 450 nukleotídból álló termék jelenlétére utaló sávot figyelhetünk meg, a hasított Hind III dekanukleotidok fragmensein kívül 4. példa Ismertetjük a rekombináns plazmid létrejöttét és a replikációt követően jellemezzük. A Rodrigues, Bolivar, Goodman, Boyer és Betlach által megadott módon (ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, Kiadd: Wierlich, Rutter és Fox, Academic Press, New York, 1976, 471—477. oldal) előállított pMB—9 DNS-plazmidot a Hind III restrikciós szakaszon Hsu I endonukleázzal hasítjuk, majd alkálikus foszfatázzal kezeljük (BAPF típus, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok). Az enzim koncpentrációja a reakcióelegyben 0,1 E/pg. DNS, a reakcióelegyet é,0 pH-jú 25 mM-os trisz-hidrogénklorid pufferben inkubáljuk 30 percen át 65 C° hőmérsékleten, majd a foszfatáz eltávolítására fenollal extraháljuk. Etanollal kicsapjuk a reakcióelegyből a foszfatázzal kezelt plazmid l)NS-t, majd Hind III kohézív végeket tartalmazó cDNS-hez adjuk 3 mól plazmid: 1 mól cDNS arányban. 7,6 pH-jú 66 mM-os 1risz-hidrogénklorid pufferben inkubáljuk a DNS-t: a reakcióelegy 6,6 mM magnéziumkloridot 10 mM ditio-treitolt és 1 mM ATP-t artalmaz, az inkubációt egy órán át 14 C° hőmérsékleten végezzük. 50 E/ml 14 DNS-liyáz jelenlétében. A reakcióelegyet az inkubáció befejezése itán az alábbiakban megadott módon előkészített E. coli X—1776 sejtekhez adjuk. 50 ml, az alábbiakban megadott összetételű táptalajon 2X108 sejt/ml sejtkoncentrációig növesztjük a tenyészetet: tripton 10 g/1; élesztőkivonat 5 g/1: nátrium-klorid 10 g/1; nátriumhidroxid 2 mM; diamino-pimelinsav 100 pg/ml és timin 40 pg/ml. A tenyésztést 37 C° hőmérsékleten végezzük. A tenyésztés befejezése után 5 C° hőmérsékleten 5000 g nehézségi gyorsulás mellett 5 percen át centrifugáljuk a sejtszuszpenziót, az üledéket 20 ml 10 mM-os hideg nátriumklorid oldatban szuszpendáljuk. Megismételjük a centrifugálást, majd a következő öszszetételű 20 ml térfogatú transzformációs pufferben szuszpendáljuk a sejteket: 75 mM kalciumklorid, 140 mM nátriumklorid és 10 mM trisz-hidrogénklorid, pH 7,5. 5 percen át jégfürdőben tartjuk a sejtszuszpenziót. Ezután újra centrifugáljuk a sejteket, majd 0,5 ml a fenti összetételű transzformációs pufferben szuszpendáljuk. A transzformációra 100 pól ilyen sejtszuszpenziót 50 pl rekombináns DNS-val keverünk (1 pg/ml). 15 perces át 0 C° hőmérsékleten inkubáljuk a keveréket, 24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
