193812. lajstromszámú szabadalom • Eljárás korrinoidok elválasztására
193812 tályosítják a B12-vitamint. A III. faktor egy oldószeres tisztítási lépés után vizes oldatból kristályosítják. Ezt az utóbbi tisztítási lépést a szabadalmi leírás nem ismerteti. Az eljárás egyik hátránya, hogy ipari méretű alkalmazásának korlátot szab az oxicellulóz gyenge fajlagos adszorpciós kapacitása. Emellett további hátrány az is, hogy az oxicellulóz regenerálása ipari méretekben csak körülményesen és költségesen oldható meg, mivel az nem történhet magában az oszlopban, ugyanis az oxicellulózt 60-70°C hőmérsékleten, 0,1 N sósavval lehet regenerálni. További nagy hátránya az eljárásnak, hogy a B12-vitamin és a III. faktor elválasztása hatalmas térfogatokat igényel. 1 kg B12-vitamin kristály kinyeréséhez az eljárásban 2,4 m3 fenol/kloroform elegyet használnak és feltehetően ilyen nagyságrendű oldószermennyiség szükséges a vizes fázisban maradó III. faktor kinyerésére is. A nagy mennyiségű fenol-kloroform-aceton oldószerelegy regenerálása pedig gazdaságosan nem oldható meg. Az előzőekben ismertetett eljárások egyike sem teszi lehetővé a vegyes mikropopulációjú mikroorganizmus tenyészettel végzett fermentáció során keletkező korrinoidok ipari méretben, szelektív és gazdaságos módon való elválasztását. Célkitűzésünk volt tehát iparilag is jól alkalmazható szelektív és gazdaságos módszer kidolgozása inkomplett és komplett korrinoidok elválasztására, valamint komplett korrinoidok, így főként B12-vitamin és III. fáktor egymástól való elválasztására. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a kobalaminoknak a kobinamidtól és kobinsavaktól való elválasztása egyetlen lépésben igen jó hatásfokkal és megfelelő tisztasággal elvégezhető valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbens segítségével történő szelektív adszorpcióval vagy elúcióval, majd kívánt esetben egy további lépésben a B12 mellől a III. faktor szelektív elűcióval eltávolítható és a B12-vitamin ismert módon kinyerhető. A találmány szerinti eljárásban a komplett és inkomplett korrinoidokat, vagyis kobalaminokat, kobinamidot és kobinsavakat együttesen tartalmazó vizes oldatból, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont —-előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldózserelegyből környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll, előnyösen pH=9,0- -10,0 közötti értéken, cianid vagy szulfit ionok, illetve ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében a komplett korrinoidokat valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbensen megkötjük, az inkomplett korinoidok pedig- az oldatban maradnak. Eljárhatunk úgy is, hogy a komplett és inkomplett korrinoidokat ismert módon, híg vizes vagy vizes-szerves oldószeres oldatból, 3 pH=2-8 közötti értéken együttesen megkötjük az adszorbensen, majd ezután az inkomplett korrinoidokat környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll, előnyösen pH=9,0-10,0 közti értékre lúgosított vizes oldattal, vagy legfeljebb 20 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy legfeljebb 5 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás ketont — előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldószereleggyel cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, a komplett korrinoidokat pedig az oszlopon megkötve maradnak. Ha a cél a B,2-vitamin és a III. faktor elválasztása, akkor mindkét eljárásváltozat esetén az adszorbensen megkötött komplett korinoidok közül a III. faktor környezeti hőmérsékleten, pH=8-ll értékre, előnyösen pH=9,0-10,0 közötti értékre lúgosított, 20- -40 tf% valamilyen vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholt — előnyösen metanolt vagy etanolt — vagy 5-20 tf% valamilyen rövidszénláncú alifás ketont — előnyösen acetont — tartalmazó vizes oldószereleggyel, cianid vagy szulfit ionok, vagy ezeket leadni képes vegyületek jelenlétében eluáljuk, majd az adszorbensen maradt B12-vitamint ismert módon, például metanollal vagy vizes acetonnal leoldjuk. Ha nincs szükség a B12-vitamin és a III. faktor elválasztására, akkor az adszorbensen maradt komplett korrinoidokat ismert módon, például metanollal vagy vizes acetonnal együtt leoldjuk. Nagy fajlagos felületű polimer adszorbensként például 10'—10'7 m pórusméretű, legalább 200 m2/g fajlagos felületű, nem ionos, nem poláros vagy gyengén poláros makroretikuláris adszorpciós gyantát alkalmazunk. Ilyenek például az Amberlite XAD 2, XAS 4, XAD 7, XAD 8 gyanták (Rohm & Haas gyártmány), a Diaion HP 20, HP 21, SP 207, HP 2 MG gyanták (Mitsubishi gyártmány). A találmány szerinti eljárásban szulfit ionokat leadni képes vegyületként alkalmazhatjuk például a nátrium- vagy kálium-hidrogénszulfitot, a nátrium- vagy kálium-metabiszulfitot, nátrium- vagy kálium-szulfitot, vizes kéndioxid oldatot, diaIkílszulfitokat, például a dimetilszulfitot. Cianid ionokat leadni képes vegyületek lehetnek például a fém-cianidok, így a kálium-cianid, nátrium-cianid, továbbá az ammónium-cianid, hidrogén-cianid. Alkalmazhatunk olyan vegyületeket is, amelyek a cianid csoportot komplex formában — ilyen például a káliumferrocianid — vagy szénatomhoz kötött formában — ilyenek például a benzilcianid, benzonitril — tartalmazzák. Az adszorpciót végezhetjük úgy, hogy az alkalmazott adszorbenst összekeverjük a korrinoidokat tartalmazó oldattal, az adszorbenst tölthetjük oszlopba, alkalmazhatunk állóágyas vagy mozgóágyas (fluid) technológiát, 4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
