193812. lajstromszámú szabadalom • Eljárás korrinoidok elválasztására
193812 A találmány tárgya eljárás korrinoidok elválasztására. A találmány szerinti eljárásban inkomplett korrinoidoknak komplett korrinoidoktól való elválasztását és a komplett korrinoidok további szétválasztását végezzük, valamilyen nagy fajlagos felületű polimer adszorbens segítségével. A korrinvázas vegyületek, amelyeknek elsőként izolált és biológiai szempontból legértékesebb tagja a Bl2-vitamin, az a-(5,6-dimetil-benzimídazolil) -kobamid-cianid, ismert gyógyhatású vegyületek. Előállításuk fermentációs úton történik. A fermentációhoz használt különböző mikroorganizmusok egymástól eltérő korrinvázas vegyületeket termelhetnek, illetve a fermentlé a fermentálás leállításakor a bioszintézis különböző fázisában lévő korrinoidokat tartalmazhat. A fermentlében lévő sejtekben együtt megtalálhatók mind a komplett. — nukleotid tartalmú — mind az inkomplett — nukleotid mentes — korrinoidok. Az inkomplett korrinoidok, így a kobinamid és a kobinsavak, biológiailag értéktelen, sőt bizonyos esetekben káros vegyületek. Jelenlétük nehezíti a tulajdonképpeni értékes hatóanyagok, a komplett korrinoidok (kobalaminok) izolálását és kristályosítását. Az inkomplett korrinoidok jelenléte még a nyers, (az összes komponenseket együtt tartalmazó) takarmánykiegészítőként alkalmazható termékben sem kívánatos, mert ismeretes, hogy például csirkéknek kobinamidot adva takarmánykiegészítőként, a Bl2-vitamin antagonistaként hat. (E. L. Smith: Vitamin Bl2, Methnen, London, 1960, 84. oldal). Adott esetben szükséges lehet a komplett korrinoidok egymástól való elválasztása is. Bizonyos fermentációs eljárásoknál, így például a 159 359 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett félfolyamatos eljárással, vegyes populádiójú mikroorganizmusokkal fermentálva az inkomplett korrinoidok mellett komplett korrinoidként főként Bl2-vitamin és az úgynevezett 111. faktor, a-(5-hidroxi-benzimidazolil)-kobamid-cianid keletkezik. A III. faktor biológiai aktivitása takarmánykiegészítőként való alkalmazás esetén azonos, vagy közel azonos a B12-vitaminéval, így takarmánykiegészítőként való alkalmazás esetén nem szükséges a B12-vitamin és a III. faktor egymástól való elválasztása. Humán terápiás célra azonban csak egységes, más kobalamin származékot nem tartalmazó kristályos B,^vitamint használnak, tehát ilyen cél esetén szükség van a Bl2-vitamin és a III. faktor egymástól való elválasztására is. A B|2-vitamintól elkülönített III. faktor kívánt esetben történő további tisztítás után önmagában is adható takarmánykiegészítőként. Az irodalomban különféle eljárások ismeretesek az inkomplett és komplett korrinoidok szétválasztására, vagyis a kobinamidnak és kobinsavaknak a kobalaminokból való 1 2 elkülönítésére. Vannak ismert eljárások a Bi2- -vitamin és a III. faktor elválasztására is. A 930 651 számú német szövetségi köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint cellulózkor töltetű oszlopon, cianid ionokat tartalmazó víz-n-butanol eleggyel végzett megoszlásos kromatográfiával választják el a különböző korrinoidokat. A szennyvízből nyert tisztított terméket, amely B12-vitamint, III. faktort és inkomplett korrinoidokat is tartalmaz, szilikagélre csapják ki, megszárítják, majd ezt viszik az oszlopra. Az eljárás hátránya az, hogy analitikai módszer, amely nagyobb, ipari méretű mennyiségek elválasztására nem alkalmas, továbbá a III. faktornak az inkomplett korrinoidoktól való elkülönítésére ad ugyan módszert, de nem adja meg, hogy hogyan különítik el ezeket a B^-vitamintól. A 143 549 számú magyar szabadalmi leírás szerint a Bl2yvitamint az egyéb korrinoidokat is tartalmazó elegyből úgy különítik el, hogy a koncentrátumot apoláros oldószer és fenolos hidroxilt tartalmazó vegyület elegyével kivonatolják, majd az oldószeres fázis-' ból a B|2-vitamint alumínium-oxidra adszorbeálják, és erről acetonnal leoldják. A 147 627 számú magyar szabadalmi leírás az előző eljárás javított változata, e szerint 4-5 pH-jú vizes közegből, fenol/kloroform 1:6 arányú keverékével kivonják a kobinamidot a kobalaminok mellől, majd a vizes fázist pH=8-9 értékre lúgosítják és fenol/kloroform 1:5 arányú elegyével kivonják a kobalaminokat. Ezt követően acetonos közegben, alumínium-oxid töltetű oszlopon kromatográfiával választják szét a B12-vitamint és a III. faktort. Az előbbi két leírásban ismertetett eljárás hátránya, hogy a íenol/kloroform eleggyel való extraháláskor igen nagyfokú az emulzióképződés: ennek következtében ipari méretben való alkalmazáskor az oldószerfázisok szétválasztása csak centrifugális szeparátorral lehetséges. Az emulzióképződés természetesen az extrahálás hatásfokát is rontja. Hátránynak tekinthető még az is, hogy az oldószerelegyek regenerálása nem valósítható meg gazdaságosan. Mindezek mellett, amiatt, hogy a kobinamid ilyen körülmények között történő extrahálása nem szelektív, elég nagy a kobalamin veszteség. A 150 555 számú magyar szabadalmi leírás olyan izolálási eljárást ismertet, amely B,2-vitamint, III. faktort és inkomplett korrinoidokat tartalmazó vizes vagy vizes-alkoholos oldatból oxicellulózon való adszorpcióval elkülönítik az inkomplett korrinoidokat, majd az így tisztított oldatból 1:7-1:8 arányú fenot/kloroíorm eleggyel, amely timolt is tartalmaz, kivonja a B,2-vitamint. A szerves fázist vízzel mossák, majd acetont adva hozzá, a B12-vitamint a vizes fázisba visszaszorítják és azt kloroformos extrahálással fenolmentesítik. Ezt követően bepárlás után kris-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
