193744. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás l-karnitin előállítására
193744-5 t% mennyiségben, a tápközegre vonatkoztatva. A gamma-butiro-betain, illetve krotono-betain hidroklorid-só, szabad belső só vagy származéka alakjában lehet jelem A fentiek szerint készített előkultúrával további tenyészeteket olthatunk be. összetételük célszerűen az előkultúra összetételével egyezik. Az átalakítani kívánt krotono-betain, gamma-butiro-betain vagy e kettő keveréke 0,1-10 t%, előnyösen 0,5-5 t% mennyiségben van jelen a tápközegben. A kolin, glutamát, acetát, dimetil-glicin és bétáin növekedési szubsztrátumokat célszerűen szintén az előkultúrával kapcsolatban elmondott koncentrációban alkalmazzuk. A tenyésztés körülményei az előkultúra tenyésztési körülményeihez hasonlóak, tehát a hőmérséklet előnyösen 20°C és 40°C közötti, különösen 30°C körüli érték, és a pH-értéket általában 6 és 8 között, előnyösen pH 7 mellett tartjuk. A fentiek szerint elindított fermentálás 20-30 óra elteltével megáll, ekkor az L-karnitin koncentrációja általában a-gamma-butiro-betain vagy krotono-betain kezdeti menynyiségének ekvivalens. A sejteket centrifugálással vagy szűréssel választhatjuk el és további kultúra beoltásához használhatjuk fel. Az L-karnitint ismert módon (J.P. Vandecasteele', Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantával végzett kromatográfiával a szürletből elkülöníthetjük, majd átkristályosítással tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárást folyamatos eljárásként is végrehajthatjuk, oly módon, hogy a sejteket kémosztátba, előnyös hígítási arány (0,04-0,2 óra-1) mellett tenyésztjük, a szakaszos tenyésztéshez hasonló körülmények között. 1. példa Krotono-betaint lebontó mikroorganizmus elkülönítése Talajmintát semleges kémhatású foszfát-pufferrel keverve mikroorganizmusokat extrahálunk. A kivonatot nagyobb szilárd részek eltávolítása céljából szűrjük, majd krotono-betaint tartalmazó tápoldatot oltunk be vele enyhe zavarosság bekövetkeztéig. A zavarosság (mint a sejtkoncentráció mértéke) 9 nap elteltével a 90-szeresére megnövekedett. Az oldat krotono-betaint már nem tartalmazott, bomlási termékként ammónia volt kimutatható. A keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével a krotono-betaint lebontó mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyertük (szilárdított agar táptalajon). Az egyik kultúrát a további műveletekhez kiválasztottuk, HK 4-nek neveztük. Ez a törzs gamma-butiro-betajnt, L-karnitint és betaint is képes hasznosítani. 2. példa Stabil, karnitin-dehidrogenáz szempontjából negatív mutáns elkülönítése A cím szerinti mutánstól kívánható, hogy a gamma-butiro-betainból vagy krotono-be-7 ‘ainból felépített L-karnitint ne katabolizál,a, sőt ideális esetben kiválassza. A HK 4 törzs kultúráját az 5 mikrogramm/ml mennyiségben vett „Acridin Mutagen ICR 191” mutagénnel szukcinátos közegben az előírásoknak megfelelően (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratory, /1972/) mutagenizáltuk, majd a sejteket szabvártyszerűen „Nutrient Broth” tápon növesztettük, hogy a mutáció láthatóvá váljék. A sejteket tartalmazó közegre oltottuk át. A kész kultúrával L-karnitint tartalmazó közeget oltottunk. Néhány óra elteltével a tenyészet elérte a logaritmikus növekedés szakaszát. Ebben az időpontban 15 mg/ml mennyiségben G-penicillint és 0,5 mg/ml mennyiségben D-cikioszerint adagoltunk (Ornstorn et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 36, 179 /1969/). Ezek az ellen-szelekcionáló ágensek csak növekvő baktériumokat ölnek, az L-karnitin hasznosítására ,már nem képes, kívánt mutánsok túlélnek, és viszonylagosan feldúsulnak. Harminc óra elteltével az élő sejtek száma az eredeti érték egyszázadára csökkent. Az antibiotikumokat elmostdk, és a tenyészetet betaint tartalmazó közegbe vittük át. Növekedés után a tenyészet megfelelő hígításait megszilárdított tápagaron szélesztettük. Az elLülönüIt sejtekből telepek nőttek; a telepeket külön-külön megvizsgáltuk. A HK 13 jelű mutánst választottuk ki. Ebből a mutánsból a karnitin-dehidrogenáz stabilan hiányzik. a mutáns tehát L-karnitint, garríma-butiro-betaint és krotono-betaint nem tud hasznosítani, betaint azonban igen. Ez a törzs — betaint, dimetil-glicint, kolint, glutanátot vagy acetátot tartalmazó tápközegben fermentálva — krotono betaint vagy gamma-butiro-be'aint L-karnítinná alakít és az utóbbit kivál jsztja. 3. példa \ HK 13 jelű 5 literes előkultúráját 1 t% betaint és 0,5 t% krotono-betain-hidrokloridot tartalmazó, vitamintartalmú ásványi közegben (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 /1983/) 30°C-on pH 7,0 mellett 32 órán át tenyésztettük. A tenyészettel azonos összetétel 15 literes közeget oltottunk, és az előkultúrával azonos módon (30°C, pH 7,0, p02= =3 ppm) 24 órán át tenyésztettük. Miután a termelés megállt, a sejteket lecentrifugáltuk, és új szakaszos kultúra oltóanyagaként használtuk fel. A 19,8 liter térfogatú felüluszó részben az L-karnitin koncentrációját enzimes elemzéssel mértük. A felüluszó rész milliliterenként 4,26 mg L-karnitint tartalmazott, ami a krotono-betain-hidroklorid kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 95,0%-os hozamnak felel meg. Az NMR-színkép sem kiindulási anyagokat, sem szennyeződéseket nem mutatott ki. Az L-karnitint az irodalomból ismert módon J.P. Vandesteele, Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantán 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
