193606. lajstromszámú szabadalom • Eljárás renin szubsztrált tetradekapeptid tisztítására
193606 A találmány tárgya eljárás az (I) képletű H-L-Asp-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Phe-L-His-L-Leu-L-Leu-L-Val-L-Tyr-L-Ser-NH2 (I) renin szubsztrát tetradekapeptid tisztítására. Ez a tetradekapeptid a biokémiában elsősorban a renin enzimrendszer vizsgálatára használható fel. Az (I) képletű tetradekapeptid előállítására számos módszer ismert [Skeggs és munkatársai: Circ. Res. XXV, 451 (1961); Brunfedt és munkatársai: Chemistry and Biology of Peptides (szerk.: Meinhofer) 183. oldal (1972); Ontjes és munkatársai: Anal. Biochem. 45, 374 (1972); Bath és munkatársai: Biochemistry 11, 2845 (1972); Parks és munkatársai: Can. J. Biochem. 52, 106 (1974); Rubin és munkatársai: Peptides (szerk.: Brunfeldt) 339. oldal (1980); Merrifield: J. Am; Chem. Soc. 85, 2149 (1963)]. Az ismert módszerek egy részében a terméket oldatfázisban, fragmenskondenzációval állítják elő, míg más esetekben a pepiidet szilárd fázisú szintézissel, polimerhez kötve alakítják ki, majd a zárólépésben hidrogén-fluoriddal hasítják le a pepiidet a polimerről, amelynek során a jelenlévő védőcsoportok is lehasadnak. Valamennyi ismert módszer közös jellemzője, hogy csak részlegesen tisztított (I) képletű pepiidet szolgáltatnak. Tapasztalataink szerint az ismert módszerekkel kapott (I) képletű vegyület maximálisan 70%-os tisztaságú. A gyakorlatban a legnagyobb problémát a szilárd fázisú szintézis során kapott nyers renin szubsztrát tetradekapeptid tisztít ása jelenti. A korábban idézett közlemények sze-. rint a tisztításhoz ioncserés vagy gélkromatográfiás módszereket alkalmaztak, így azonban csak részlegesen tisztított termékhez jutottak. A termék szennyezései esetenként még a kevésbé érzékeny klasszikus tisztaságvizsgálati módszerekkel is kimutathatók voltak. A renin szubsztrát tetradekapeptid tisztítása során jelentkező nehézségek annak tulajdoníthatók, hogy a szintézisben igen sokféle melléktermék képződésére van lehetőség, így például ha az acilezési reakciók hozama elmarad a 100%-tól, töredék szekvenciák képződhetnek. Különösen érvényes ez a térgátolt aminosavak és hisztidin kapcsolási reakciójára. A peptidkémiai védőcsoportok acidolízises lehasítása is különféle melléktermékek képződéséhez vezethet, így például a tirozin alkileződésével és az aszparaginsav izomerizálódásával kell számolnunk. A képződött melléktermékek szerkezete esetenként csak jelenléktelen mértékben tér el a kívánt pepiidétől, így érthető, hogy a klasszikus tisztítási és elválasztási módszerek tiszta termék előállítására alkalmatlanoknak bizonyultak. Vizsgálataink során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a renin szubsztrát tetradekapeptidet rendkívül tiszta (legalább 98%-os, esetenként 99% körüli) állapotban ál1 2 líthatjuk elő, ha a tisztítást nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiás úton, reverz fázisú (azaz felületén apolárossá tett) szilikagél tölteten, speciális összetételű eluálószerrel végezzük, majd az elkülönített terméket sómentesítjük. A találmány tárgya tehát eljárás az (I) képletű renin szubsztrát tetradekapeptid tisztítására. A találmány szerint úgy járunk el, hogy szennyezett renin szubsztrát tetradekapeptidet nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiás úton, reverz fázisú szilikagél tölteten, 20—35 térfogat % acetonitrilből és 65—80 térfogat %, 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes pufferoldatból álló eluálószer felhasználásával kromatografálunk, az eluátumból elkülönítjük a renin szubsztrát tetradekapeptid és a pufferoldatban lévő só keverékét, a keveréket sómentesítés céljából reverz fázisú szilikagél tölteten a só előzetes lemosása után 20—35 térfogat % acetonitrilből és 65—80 térfogat %, 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes savoldatból álló eluálószer felhasználásával újra kromatografáljuk, vagy 1700-nál kisebb kizárási porozitású agaróz- vagy szacharóz-gélen átszűrjük és a géloszlopot 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes savoldattal mossuk, végül a kapott eluátumból elkülönítjük a legalább 98%-os tisztaságú renin szubsztrát tetradekapeptidet. A találmány szerinti eljárás kromatográfiás lépéseiben töltetként felhasznált reverz fázisú szilikagél a felületen célszerűen oktadecil-szililezéssel, oktil-szililezéssel vagy butil-szililezéssel apolárossá tett töltet lehet. A szennyezett renin szubsztrát tetradekapeptid kromatografálásához felhasznált eluálószer tetszés szerinti vizes pufferoldatot tartalmazhat; az egyetlen megkötés az, hogy a vizes pufferoldat pH-ja 2 és 2,5 közötti érték legyen. Vizes pufferoldatokként előnyösen használhatunk savasan hidrolizáló ammóniumsó-oldatokat, például trietil-ammónium-foszfát vagy trietil-ammónium-formiát vizes oldatát. Kiemelkedően előnyös pufferoldatnak bizonyult a trietil-ammónium-foszfát 2,25 pH-értékű vizes oldata. A szennyezett renin szubsztrát tetradekapeptid kromatografálásakor kapott eluátumból célszerűen liofilizálással különítjük el a renin szubsztrát tetradekapeptid és a vizes pufferoldatban lévő só keverékét. Ezt a keveréket a találmány szerinti eljárás következő lépésében kromatografálással vagy gélszűréssel sómentesítjük. Ha a sómentesítést kromatografálással végezzük, adszorbensként a fent ismertetett, reverz fázisú szilikagél tölteteket használhatjuk. A sómentesítéshez felhasznált, 20— 35 térfogat % acetonitrilből és 65—80 téríogat% vizes savoldatból álló eluálószer bármilyen szerves vagy szervetlen sav vizes oldatát tartalmazhatja; az egyetlen megkötés az, hogy a vizes savoldat pH-ja 2 és 2,5 közötti érték legyen. Az eljárásban például hangyasav, trifluor-ecetsav, foszforsav vagy 2 5 10 '5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
