193606. lajstromszámú szabadalom • Eljárás renin szubsztrált tetradekapeptid tisztítására
193606 sósav vizes oldatát használhatjuk. Kiemelkedően előnyösnek bizonyult a 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav oldat (pH = 2,25). Ha a sómentesítést gélszűréssel végezzük, az eljárásban 1700-nál kisebb kizárási porozitású agaróz- vagy szacharóz-géleket (például Sephadex gélt) használhatunk. A géloszlopot 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes savoldattal, különösen előnyösen 2 N vizes ecetsav-oldattal mossuk. A sómentes eluátumfrakciókból célszerűen liofilizálással különítjük el a renin szubsztrát tetradekapeptidet. A terméket legalább 98%-os tisztasággal kapjuk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában részletesebben ismertetjük. Példa 5,4 g, szilárd fázisú szintézissel és azt követő hidrogén-fluoridos hasítással kapott nyers renin szubsztrát tetradekapeptidet (Merrifield: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) 50 ml ecetsavban oldunk, és az oldatot desztillált vízzel 500 mi re hígítjuk. A nem oldódó részt kiszűrjük, és a szűrletet liofilizáljuk. A kromatografálást 30—40 pm szemcseméretű Vydac C-18 adszorbenssel (oktadecil-szilillel módosított szilikagél) töltött, 22 x 380 mm méretű oszlopon végezzük. 0,8 g, a fentiek szerint kapott liofilizátumot 20 ml eluálószerben oldunk (az eluálószer 27 térfogat % acetonitril és 63 térfogat% 0,1 mólos vizes trietil-ammónium-foszfát-oldat (pH = =2,25) elegye), az oldatot Labormim S 13 pumpa segítségével felvisszük az oszlopra, majd az oszlopot körülbelül 7—8 ml/perc sebességgel a fenti összetételű eluálószerrel eluáljuk. összesen 500 ml eluálószert használunk fel. Az eluátumot 10 ml térfogatú frakcióba gyűjtjük, az egyes eluátumfrakciókból mintát veszünk, és Uvicord-I készüléken, 254 nm hullámhosszon mérjük a minta UV-elnyelését. A 254 nm hullámhosszon elnyelést mutató eluátumfrakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Renin szubsztrát tetradekapeptid és trietil-ammónium-foszfát keverékét kapjuk. A kromatográfia befejezése után az oszlopot 200 ml 1:1 térfogatarányú acetonitril — 0,1 mólos vizés trietil-ammónium-foszfát-oldat eleggyel, majd 200 ml vízzel és200ml acetonitrillel mossuk. Ezután az oszlopot 1:9 térfogatarányú acetonitril — 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat eleggyel egyensúlyba hozzuk. 2 g, az előző műveletben kapott liofilizátumot, amely renin-szubsztrát tetradekapeptid mellett trietil-ammónium-foszfátot tartalmaz, 80 ml desztillált vízben oldunk, és ezt az oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopról a sószerű anyagokat 250 ml 1:9 térfogatarányú acetonitril — 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat eleggyel lemossuk, majd a renin szubsztrát tetradekapeptidet 200 ml 20:80 térfogatarányú, 200ml 25:75 térfogatarányú, 200 ml 30:70 térfogat3 arányú; végül 200 ml 35:65 térfogatarányú acetonitril — 0,1 tömeg%-os vizes trifluor-ecetsav oldat eleggyel eluáljuk. Az oszlopot 200 ml vízzel, majd 200 ml acetonitrillel regeneráljuk. A sómentes eluátumfrakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 1020 mg renin szubsztrát tetradekapeptidet kapunk, amely kromatográfiás vizsgálat szerint 98,7%-os tisztaságú; R/= 9,6 perc (a termék tisztaságát nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiás úton, Knauer Lichtosorb RP18 oszlopon, 2 ml/perc áramlási sebesség fenntartásával határoztuk meg, eluálószerként 27:63 térfogatarányú acetonitril — 0,1 mólos trietil-ammónium-foszfát oldat elegyet használtunk) . Más megoldás szerirít a renin szubsztrát tetradekapeptid és trietil-ammónium-foszfát keverékét a következőképpen sómentesítjük: 2 g keveréket 80 ml desztillált vízben oldunk, és az oldatot Sepharose G-15 adszorbenssel töltött üvegoszlopon átszűrjük. A géloszlopot 0,2n vizes ecetsav-oldattal mossuk. 800 ml mosófolyadékot használunk fel. Az eluátumot 10 ml térfogatú frakciókba gyűjtjük és az egyes frakciók mintáinak UV-elnyelését Uvicord-I készüléken, 254 nm hullámhosszon mérjük. A 254 nm hullámhosszon elnyelést mutató eluátumfrakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 1 g renin szubsztrát tetradekapeptidet kapunk, amelynek tisztasági foka és fizikai állandói megegyeznek az előzőekben megadottakkal. 4 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) képietü H-L-Asp-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Phe-L-His-L-Leu-L-Leu-L-Val-L-Tyr*L-Ser-NH2 (I) renin szubsztrát tetradekapeptid tisztítására, azzal jellemezve, hogy szennyezett renin szubsztrát tetradekapeptidet nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiás úton, reverz fázisú szilikagél tölteten, 20—35 térfogat% acetonitrilből és 65—80 térfogat%, 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes pufferoldatból álló eluálószer felhasználásával kromatografálunk, az eluátumból elkülönítjük a renin szubsztrát tetradekapeptid és a pufferoldatban lévő só keverékét, a keveréket sómentesítés céljából reverz fázisú szilikagél tölteten, a só előzetes lemosása után, 20—35 térfogat % acetonitrilből és 65—80 térfogat%, 2 és 2,5 közötti pH-értkű vizes savoldatból álló eluálószer felhasználásával újra kromatografáljuk, vagy 1700-nál kisebb kizárási porozitású agaróz- vagy szacharóz-gélen átszűrjük és a géloszlopot 2 és 2,5 közötti pH-értékű vizes savoldattal mossuk, végül á kapott eluátumból elkülönítjük a legalább 98%-os tisztaságú renin szubsztrát tetradekapeptidet. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65 3
