193585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok és makroorganizmusok sejtkultúráinak tenyésztésére alkalmas szilárd táptalajok előállítására
193585 hogy mindegyike három-három üreget tartalmazzon. Az így kialakított diffúziós kamrákat ezután 0,85%-os nátrium-klorid oldatban tömegük 4,5-szörösére duzzasztjuk, majd l —-1,5 órán át sterilizáljuk és 199-es közeggel átitatjuk. A diffúziós kamra három üregének egyikébe 199-es tápközegben eloszlatott 2 x 106 menynyiségű csontvelősejtet helyezünk, a másikba 2 x 105 mennyiségű, fiziológiás oldatban szuszpendált Staphylococcus Cowan törzset helyezünk, majd a diffúziós kamrákat syngén-állatok (Jajtiszta) hasüregébe implantáljuk. Az első három napon a myeloid sejtek növekedési zónáiban főleg makröfág és granulocita koléniákat figyelhetünk meg. A makrofágok formája és mérete különböző. A hetedik napon a makrofág-kolóniák száma jelentős növekedésnek indult, és a makrofágok és lymphociták között citoplazmás hidak, valamint szövettipusú kapcsolódások, histiocyták, valamint osteoblastomaszerű sejtek kialakulása figyelhető meg. A retikuláris sejtekből és neutrophylekből kolóniák fejlődnek ki. A második üregben jellegzetes, kerek, sima Staphylococcus kolóniák képződnek, amelyek száma az idő függvényében növekedett, öszszeíolytak,és az üregben folyamatos növekedési zónát alakítottak ki. 7. példa Az A és C oldatokat az 1. példában, a B oldatot a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő. A reakciókeverék az akrilamid és N,N’metilén-bisz-akrilamid monomereket 15,0 : : 0,027 tömegarányban tartalmazza és a keverék fiziológiás oldathoz viszonyított tömegaránya 1:7. Ezt a reakciókeveréket ezután reaktorba töltjük,és a képződő poliakrilamid-gélből egy 120 x 75 x 2,2 mm és egy 120 x 75 x 1,0 mm nagyságú csíkot képezünk, amely utóbbin 4 x 1,2 mm-es üregeket alakítunk ki, egymástól 1,7 mm távolságban, koaxiális elrendezésben. A kopolimerizációt 40—50 percig végezzük, majd a csíkokat a kiindulási monomerkeveréknek megfelelő összetételű keverékkel itatjuk át, és oly módon helyezzük egymásra, hogy zárt üregek alakuljanak ki, és egy egységes blokk képződéséig egyben tartjuk őket. Ekkor részekre választjuk szét, úgy, hogy mindegyik egy üreget tartalmazzon. Az így nyert diffúziós kamrákat ezután fiziológiás oldatban mossuk és 0,85%-os fiziológiás sóoldatban tömegük 2,8-szorosára duzzasztjuk, majd 1 —1,5 órán át sterilizáljuk, végül 199-es tápközeggel telítjük. Intakt syngén állatok combcsontvelőjéből a csontvelősejteket (4 x 106 mennyiségben) 0,2 ml mennyiségű 199-es tápközegben szuszpendáljuk, és a diffúziós kamrába helyezzük, majd azokat a syngén recipiensek hasüregébe implantáljuk. 13 8 A sejtek in vivo tenyésztése után a diffúziós kamrát a hasüregből kiemeljük és mikroszkopikus úton a sejt-monoréteget (növekedési zóna, sejtkultúra), valamint a sejtkultúrákról készített kontakt-preparátumot megvizsgáljuk. A normál állatok hasüregében elhelyezett diffúziós kamrákban tenyésztett csontvelősejtek a tenyésztés harmadik napján heterogén sejtszerkezetet mutatnak, amelyekre az intakt csontvelő volt jellemző. A hetedik napon e sejtek egy része degenerálódik, egy másik rész meghatározott formájúvá kezd átalakulni. Megfigyelhetők a granulocyták differenciálódásának különböző lépései. Nem differenciálódott szövetek gyorsan növekedő fonalainak közelében metamyelocita sejtek csoportokat alakítanak ki, és felületükön boltozatok képződnek. Az érett granulocyták neutrophylként jellemezhető magot tartalmaznak. Közbülső formáikban kifejezett mag-szegmentálódás figyelhető meg. A növekedési zónába nagy epithelsejtek (40 pm) képződnek jelentéktelen burjánzásokkal a felületükön, a monorétegben csoportokká alakulnak és elszigetelődnek, magjuk ellaposodó formájú és a citoplazmában hiányoznak a fagocitált zárványok. Rendkívül életképesnek mutatkoznak a monocyták. Fagocita-vacuolák gyakran tartalommal vannak kitöltve. A monocyták magjuk babszerü formája alapján azonosíthatók, amely gyakran excentrikusán helyezkedik el. Hosszabb tenyésztési idő után a mag kerekebb formájúra alakul. A monocyták gyakran az epithelsejtek közelében helyezkednek el, de aggregációra nem mutatnak hajlandóságot. A 21 napos kultúrákban a növekedő sej tek kitöltik a diffúziós kamra üregét és egy meghatározott sejtorganizációt képeznek. A közvetlenül a felületen fekvő réteget epithelsejtek alkotják, majd egy csoport monozyta, zsírsejt és fiatal formájú neutrophyl következik. Az érett formák a periférián gyűlnek össze. A limphocytaszerű és csírasejtek az adhéziós rétegen belül helyezkednek el. A növekedési zónában zsírsejtek jelennek meg kicsi, sűrű maggal, gyakran kétmagú formában. Az elektromikroszkópos felvételen jól felismerhető a citoplazmán elhelyezkedő, kis zsírcseppek alakjában. A lipidzárványok gyakran fészekszerű formában alakulnak ki, néha összefolynak és 40 pm nagyságú cseppeket alakítanak ki. A zsír akkumulációja következtében ezek a sejtek néha 120 pm nagyságot is elérnek. Egy elszigetelt vacuolamembrán sejten belüli lipidszintézisre utal. Egy kerek és ovális formájú mag kondenzált kromatinból tevődik össze. Az érett sejtek citoplazmája számos mitochondriomát tartalmaz. A korábbi zsírakkumuláció egyes lépései során citoplazma semlegesítődik. A zsírsejtek csoportok képzésére hajlamosak és gócokat képeznek a granulocitált kolóniák között, de funkcionális függőségüket hosszabb ideig megtartják. 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
