193538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teichomycin A2 tiszta 1,2,3,4 és 5 faktorok elkülönítésére
193538 hoz fokozatosan hozzáadjuk a megfelelő, kiválasztott ásványi bázist, közel sztöchiometrikus mennyiségben. A keletkező alkáli- vagy alkáliföldfémsót ezután nem-oldószerrel való. kicsapással és szűréssel nyerjük ki. Egy másik megoldás szerint ezeket a sókat lényegében vízmentes alakban állíthatjuk elő, lioíilizálással. Ebben az esetben a kívánt sókat tartalmazó vizes oldatokat- amelyeket úgy állítunk elő, hogy a szabad savas alakot megfelelően megválasztott alkáli- vagy alkáliföldfém-karbonáttal vagy -hidroxiddal sóvá alakítjuk, mimellett a bázist olyan mennyiségben adagoljuk, hogy pH 7—8 értéket érjünk el az oldhatatlan anyagok eltávolítására szűrjük és liofilizáljuk. A szerves ammóniumsókat úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelően megválasztott amint hozzáadjuk a teichomycin A2 1,2,3,4 vagy 5 faktor megfelelő oldószerrel, pl. propilénglikoHal elkészített oldatához — amely a faktort a szabad sav alakban tartalmazza —, majd az oldószert és az amin-felesleget ledesztilláljuk. Egy másik megoldás szerint a két reagenst minimális mennyiségű vízben reagáltatjuk, majd a kapott sót nem-oldószer hozzáadásával kicsapjuk. Mint az előbbiekben említettük, a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor egy bázisos funkciót is tartalmaz, amely sóvá alakítható. A gyógyászatilag elfogadható savaddiciós sók előállítása — amelyekhez ismert módon juthatunk, oly módon, hogy a tiszta egyedi faktorokat erős savval, előnyösen ásványi savval reagáltatjuk — ugyancsak a találmány tárgyát képezi. 2. példa A teichomycin A2 2 faktor nátriumsójának előállítása 9 II. Táblázat A teichomycin A2 1, 2, 3, 4 és 5 faktor Mikroorganizmus Vizsgált törzsek száma 1 faktor Staph, aureus 5 0,8-1,6 Staph, epidermídis 4 0,2-1,6 Streptoc. pyogenes 1 0,05-0,1 Streptoc. pneumoniae 6 0,1-0,2 Streptoc. faecalis 5 0,2-0,4 Streptoc. mitis 1 0,025 Streptoc. salivarius 1 0,2 Streptoc. sanguis 1 0,1 Streptoc, bovis 1 0,4 Streptoc. agalactiae 1 0,1 Az 1,2,3,4 és 5 faktor mikrobiológiai potenciáljának a komplexhez való viszonyát agar-diffuziós módszerrel határozzuk meg, S. aureus ATCC 6538 mint teszt-mikroorganizmus és teichomycin A2 komplex mint standard alkalmazásával. A teichomycin A2 2 faktor oldatát (150 mg, 15 ml térfogatú vizes oldat) pH 8,0-ra állítjuk be, 0,1N NaOH cseppenkénti hozzáadásával. A kapott oldatot szűrjük, az oldatot átvisszük egy fagyasztva-szárító rendszer kamrájába és megfagyasztjuk. A fagyasztás befejeződése után a kamrát 1,333 22-10 Pa eléréséig evakuáljuk és a jeget szublimáljuk, oly módon, hogy a fütőlemezt 0°C-ra melegítjük. Az eljárást addig folytatjuk, amig a termék csaknem száraz (kb. 1 % nedvesség). Az így kapott teichomycin A2 2 faktor 3:1 metilcelloszolv:H20 elegyben (25 ml) 0,1N HCl-val végzett titrálása arra mutat, hogy két titrálható funkció van jelen, amelyet pK 7,03 és 4,78 jellemez. Az előbbi eljárást követve, de teichomycin A2 1,3,4 vagy 5 faktorból kiindulva a megfelelő nátriumsókat állítjuk elő. A végtermékként kapott sók nátriumtartalmának meghatározása azt igazolja, hogy mononátriumsó keletkezik. A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor in vitro antibakteriális aktivitását — amelyek főként Gram-pozitív baktériumokkal szemben mutatkoznak aktívnak — klinikai Staphylococcus és Streptococcus izolátumokkal szemben határozzuk meg, mikrotitrálásos rendszerben, kétszeres hígítás alkalmazásával. A Staphylococcusok esetében Penassay húslevest (Difco), a Streptococcusok esetében pedig Todd-Hewitt húslevest (Difco) használunk. Az egy éjjelen át tenyésztett hüsleves-kulturákat oly mértékben hígítjuk, hogy a végső inokulum kb. 102 3 telepképző egységet — milliliterenként — tartalmazzon. A minimális gátló koncentrációkat (MIC) úgy határozzuk meg, mint azt a legalacsonyabb koncentrációt, amely 18—24h-s inkubálás után, 37°C-on nem tesz lehetővé látható növekedést. A kapott eredményeket a II. táblázatban mutatjuk be. 10 vitro antibakteriális aktivitása M.I.C / jig/ml/, teichomycin A2 2 faktor 3 faktor 4 faktor 5 faktor 0,8-1,6 0,4-0,8 0,2-0,8 0,2-0,8 0,1-1,6 0,2-0,8 0,2-0,8 0,2-0,8 0,025-0,1 0,025-0,05 0,006-0,05 0,006-0,05 0,05-0,1 0,05-0,1 0,05-0, 1 0,05-0,1 0,1-0,4 0,1-0,2 0,1-0,4 0,1-0,4 0,025 0,0125 0,025 0,025 0,2 0,1 0,05 0,05 0,1 0,1 0,05 0,05 0,4 0,2 0,4 0,4 0,1 0,05 0,1 0,1 Közelebbről: a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor, valamint a standardként alkalmazott teichomycin A2 komplex megfelelő mennyiségét dimetilformamidban oldjuk, 2000 pg/ml koncentráció elérésére. Ezeket az oldatokat tovább hígítjuk 1% szarvasmarha-szérumot 5 10 15 20 25 30 35 40 in 65 6
