193538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teichomycin A2 tiszta 1,2,3,4 és 5 faktorok elkülönítésére

193538'

I. táblázat (folytatás) Teichomycin Retenciós idő /perc/

A2 faktor

3

3

4

5

3,5-dihidroxitoluol /belső standard/

23.3 25,8

26.4

8,84

5

10

Oszlop: 5 p Zorba^ODS (Du Pont)

Mozgó fázis: lineáris grádiens 0%B-tői

50%B-ig^ A-ban 40 perc alatt 15

A) (9:1) 25 rnM NaH2P04:acetonitril 0,1N NaOH-dal pH 6,0- -ra beállítva

B) (3:7) 25 mM NaH2P04:acetonitril 0,IN NaOH-dal pH 6,0- 20-ra beállítva

Áramlási sebesség: 2 ml/perc Detektor: UV fotométer 254 nm-en.

A hasonló HPLC profilú frakciókat egyesítjük és az oldószert csökkentett nyomáson 25 ledesztilláljuk. A visszamaradt vizes oldatokat 10 gramm szilanizált szilikagél 60-at (Merck) tartalmazó oszlopon vezetjük át.

Az oszlopot desztillált vízzel mossuk az ammóníumformiát eltávolítására, majd 50%-os 30

vizes acetonitrillel eluáljuk.

Az eluátumot kis térfogatra töményítjük be, butanol hozzáadásával, a víz ledesztillálásának megkönnyítésére, majd 1:1 acetonitril: etiléter eleggyel kicsapást végzünk. Ez- 35 zel az eljárással 410 mg tiszta teichomycin A2 1 faktort és 770. mg 2 faktort kapunk.

A teichomycin A2 3 faktort, a teichomycin A2 2 faktorral alkotott 1:1 keverék alakjában HPLC-vel tisztítjuk tovább félpreparatív ősz- 40 lopon, a következő műveleti körülmények között.

Oszlop: Whatman Partisii® ODS M 9

10/50

Mozgó fázis: 0,2%-os vizes ammonium- 45

formiát 76:24 acetonitril

elegy

Áramlási sebesség: 4,5 ml/perc

Detektor: UV fotométer 254 nm-en

Terhelés: 20 mg 0

A tisztítást ebben az esetben is követjük, oly módon, hogy mindegyik frakciót HPLC-vel vizsgáljuk meg.

A tiszta teichomycin A2 2 faktort és a tiszta teichomycin A2 3 faktort tartalmazó frak- 55

ciókat egyesítjük, sómentesítjük és az előbbiekben leírt módon kicsapjuk. (Kitermelés:

510 mg teichomycin A2 2 faktor és 520 mg teichomycin A2 3 faktor).

Az első oszlopról kapott, a 4 és 5 frakciót 1:1 arányban tartalmazó frakciókat (kb. 500 mg) egyesítjük azzal a (kb. 490 mg súlyú (keverékkel, amely a 4 és 5 faktor keveréke és amelyet ugyanígy állítunk elő egy második párhuzamos elkülönítés során. A 5

frakciókat félpreparatív HPLC-Vel választjuk szét ugyanolyan műveleti körülmények alkalmazásával, amelyeket az előbbiekben a teichomycin A2 3 faktor tisztításával kapcsolatban említettünk. 350 mg teichomycin A2 4 faktort és 300 mg teichomycin A2 5 faktort kapunk.

A teichomycin A2 egyes tiszta frakcióinak fizikokémiai jellemzői

A teichomycin A2 1 faktor fehér amorf por, amely melegítés hatására kb. 220°C-on sötétedni kezd és 225°C-on teljesen elbomlik. A faktor jellemzői a következők:

a) Korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, valamint dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban;

gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;

rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitriiben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;

b) UV abszorpciós spektruma, amelyet az 1. ábrán mutatunk be, a következő helyeken tartalmaz abszorpciós maximumokat:

— 0,1N sósavban:

larnbdamaï 278 nm (E"fö, = 49,5)

— pH 7,4 foszfát pufferben: lambdama* 278 nm (Ej*TM= 50,0)

— 0,1N nátriumhidroxidban: lambdamajc 297 nm (E1*m — 72,1);

c) IR abszorpciós spektruma, amelyet a 2. ábrán mutatunk be, a következő helyeken tartalmaz abszorpciós maximumokat: 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);

d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen

kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súly veszteség = 8,5%),

amely a következő közelítő %-os összetételt mutatja (átlag): szén 56,70; hidrogén 4,90; nitrogén 6,65; klór 3,80; oxigén (a különbségből) 27,95%;

e) retenciós idő (tu) 21,2 perc, ha a mintát inverz fázisú HPLC-vel elemezzük 5 p-os Zorbax®ODS oszlopot alkalmazva és az eluálást 40 perc alatt a B oldat 0-50%-os lineáris grádiense mellett, A oldattál végezve (A oldat: 9:1 25 mM NaH2P04/acetonitril elegy, 0,1 N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2P04/ /acetonitril 0,1N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett (belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, t*. 8,84 perc) ;

f) a következő jel-çsoportok a 270 MHz-es lH NMR spektrumban (a teljes spektrumot a 3. ábrán mutatjuk be), amelyet DMSO-d6-ban veszünk fel, néhány csepp D20 hozzáadása mellett) koncentráció: 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard: delta 0,00 ppm): 0,8—1,5 (m),

4

3