193528. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978C ciklusos peptid-acil-származékok előállítására
193528 szerrendszert használva és UV fényben detektálva. Körülbelül 10 perc múlva az oldat gyorsan megzavarosodik és a lúgfogyasztás emelkedik. 30 perc múlva csökken a zavarosodás sebessége és a lúgfogyasztás üteme, a reakció végét jelezve. Ennek ellenére a reakciót még 90 percig folytatjuk a teljes átalakulás biztosítása céljából. 2 órai reagáltatás után a képződött anyagot azonnal liofilizálva 12,7 g Nom-t-BOC-A-21978C C2 és C3 faktort kapunk. Hasonló eljárást alkalmazva két 10 g-os és egy 30 g-os reakciót is indítunk. Ezeknél a reakcióidő csak 40 perc. A két 10 g-os kísérletből 11,9 illetve 12,1 g terméket kapunk. A 30 g-os reakció 35,4 g terméket eredményez. 4. preparálás Az A-21978C Nom-t-BOC mag előállítása A. A. utahensis fermentációja Az A. utahensis fermentációját az 1. preparálás A. fejezetében leírtak szerint hajtjuk végre, ferde A. táptalajt és I. szaporító táptalajt használva és a szaporító táptalajt mintegy 66 óráig inkubálva. B. Nom-t-BOC komplex dezacilezése Az A-21978C N*„,-t-BOC komplexet (1185g nyers szubsztrát, mely körülbelül 176 g A-21978C komplexet tartalmaz) hozzáadjuk a fermentációs közeghez. A dezacilezést az 1. preparálás B. fejezetében leírtak szerint hajtjuk végre. HPLC elemzéssel kimutatva a dezacilezés körülbelül 24 óra alatt teljes. C. A-21978C Nor„-t-BOC- mag izolálása A B. fejezetben leírtak szerint kapott fermentlevet (100 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel) átszűrjük. A szűrletet 7,5 liter gyantát (DIAION) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át; az oszlopot vízzel (38 liter) mossuk. Az eluciót szilikagél/C18 HPLC-vel ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon UV detektálással. Kevés mag a mosófolyadékkal eluálódik. A magot ezután a következő víz/acetonitril elegyekkel eluáljuk: (95:5) —- 40 liter; (9:1) — 40 liter és (85:15) — 100 liter. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk és gyorshütéssel szárítjuk, 298,5 g félig tisztított A-2I978C Nom -t-BOC magot kapunk. D. Az A-21978C No,„-t-BOC mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott, félig tisztított A-21978C Nom-t-BOC magot (30 g) 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó víz/acetonitril (9:1) elegyben (75 ml) oldjuk. Az oldatot 3,33 szilikagél [Quantum LP-1]/C,8 töltetet tartalmazó, a fenti oldószerrendszerrel kiegyensúlyozott 4,7x192 ernes acéloszlopra visszük fel. Az oszlopot nyomás alatt 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó víz/acetonitril/metanol (80:15:5) eleggyel eluáljuk. 350 ml-es frakciókat gyűjtünk és a terméket 280 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frak13 ciókat egyesítjük, az oldószer eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 18,4 g tisztított A-21978C Nom-t-BOC magot kapunk. Az A-21978C Nom-t-BOC mag jellemzői a következők: (a) Alak: fehér amorf szilárd anyag, mely rövidhullámú UV fényben fluoreszkál (b) Tapasztalati képlet: C67H91Nl7027 (c) Molekulasúly: 1565 (d) Oldhatóság: vízben oldódik (e) IR abszorpciós spektrum (KBr) maximumai (cm-1): 3345 (széles), 3065 (gyenge), 2975 (gyenge), 2936 (gyenge), —1710 (váll), 1660 (erős) 1530 (erős), 1452 (gyenge), 1395 (közepes), 1368 (gyenge), 1341 (gyenge), 1250 (közepes), 1228 (közepes), 1166 (közepes-gyenge) és 1063 (gyenge) (f) UV abszorpciós spektrum maximumai (90% etanol) : 220 nm (e 42,000) és 260 nm (e 10,600) (g) HPLC retenciós idő = 6 min, 4,6x300 m n-es szilika gél/C l8 oszlopon 0,2% ammóniam-acetátot tartalmazó víz/acetonitril/metanol (80:15:5) oldószert használva 2 ml/min áramlási sebességgel, UV detektálással. 5. preparálás Az A-21978C No^-t-BOC mag alternatív tisztítása A 4. preparálás C. fejezetében leírtak szerint kapott, félig tisztított A-21978C Nom-t-BOC magot (10,8 g) vízben oldjuk és 80 ml Amberlite IRA-68 gyantát (acetát-ciklus) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot v zzel mossuk és 5 ml/min áramlási sebességgel, egymás után 0,05 n ecetsavoldattal (1080 ml), 0,ln ecetsavoldattal (840 ml) és 0 2n ecetsavoldattal (3120 ml) eluáljuk, 120 ml-es frakciókat gyűjtve. Az oszlop elucóját analitikai HPLC-vel szilikagél/C18 tölteten, 0,2% ammónium-acetátot tartalmazó víz/acetonitril/metanol (80:15:5) oldószerrendszert használva ellenőrizzük és a terméket 254 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük; az oldat pH-ját piridinnel 5,8-ra állítjuk be; a kapott oldatot vákuumban mintegy 200 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátumhoz vizet adunk és a képződött oldatot a piridin eltávolítása céljából ismét bepároljuk. A maradékból gyorshütéses szárítás után 3,46 g tisztított A-21978C Nom-t-BOC magot kapunk. 14 6-14. preparálás Számos hasznos N-alkanoil-aminosav előállítását írja le a 4,293,483 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (lásd ,. táblázat, 9-16. oszlop). E vegyületeket a következő általános eljárással állítjuk elő: A megfelelő alkánsavkloridot cseppenként hozzáadjuk a piridinben oldott megfelelő ami-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
