193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
szelektáljuk, a donor amiláz aktivitása szerint osztályozva Ha a vektor tartalmaz antibiotikum rezisztencia markert, könnyen el lehet végezni egy előzetes osztályozást is, a sejteket olyan agar lemezre szélesztve, amelynek táptalajában antibiotikum található. Csak a kívánt rezisztenciát tartalmazó sejtek növekednek Oldható keményítőt adva a lemezhez az amiláz aktivitás határozható meg Növesztés után a lemezeket híg jódoldattal kezeljük, vagy jódgőzzel hívjuk elő Csak azok a telepek, amelyek rendelkeznek a megfelelő amiláz aktivitással, mutatnak világos területeket, ahol a keményítő elbomlott és ennek megfelelően nem festödik a jóddal Ha a rekombináns plazmidot tartalmazó sejtek az alfa amilázt intracellulárisan termelik, a sejteket lizisnek kell alávetni, hogy az enzim jelenléte kimutatható legyen Az E. coli sejtjei legkényelmesebben T4 bakteriofággal vagy D- cikloszerinnel lizalhatók Azt figyeltük meg hogy amikor B subtilist használunk a klméra plazmidhoz gazda organizmusként, a sejt által termelt alfa-amiláz enzim kijut a sejtből a tápközegbe Ez a felismerés igen fontos az enzim nagyipari termelése szempontjából, mivel a sejt lízisének költséges lépését el lehet kerülni. A B subtlhs amiatt is különösen alkalmas gazdaszervezet, mert olyan fajba tartozik, amely könnyen alkalmazható az ipari fermentációkhoz A kiméra plazmid, amelyet a gazdasejt képez, könnyen izolálható ismert módszerekkel Ilyen módszer pl Clewell és Helinski standard derített lizátum módszere ( Biochemistry, 9, 4428 4440, -1970)) Ezeket CsCI sürüséggradiens ultracentrifugálással lehet tisztítani. Az alfa amiláz gént tartalmazó kiméra plazmidot ezeknek a géneknek a donorjaként is használhatjuk. A plazmidokat egy megfelelő restrikciós endonukleázzal elhasítva alfa-ami - laz gént tartalmazó lineáris DNS keletkezik A lineáris DNS t ezután szacharóz gradiens ultra - cenlrifugálással tisztítjuk Ez a genetikai anyag kombinálható ezután egy másik vektorral, egy újabb kiméra plazmidot alakítva ki. A kiméra plazmidot tartalmazó gazdasejt által termelt alfa amiláz megtartja hőstabil tulajdonságait Ez igaz még abban az esetben is, ha a gazda mikroorganizmus mezofil, és nem termőéi Sőt, a termék is, amely a klónozott mikroorganizmusból származó amiláz segítségével keletkezik keményítőből, azonosnak latszik azzal a termékkel, amelyet a donor mikroorganizmus amiláza termel. A találmány szerinti eljárást fel lehet használni két vagy több különböző, hőstabil alfa amilázt kódoló gént tartalmazó plazmid bevitelére is azonos mikroorganizmusba Pl E coli RRi-et módosítani lehet olyan kiméra plazmidok beiktatásával, amelyet egy höstabil alfa - amilaz génnek pBR 325 és pWC 625 vektorokkal történő kombinálásával nyertünk A gazda sejt mindkét plazmidot beépíti, replikálja és ki fejezésre juttatja 5 A következő példák bemutatják jelen találmány néhány alkalmazását. Hacsak másképpen nem jelezzük, minden arány és százalék súlyban értendő. Minden törzs, amely ATCC számot visel, ren. delkezésre áll az American Type Culture Çollection-nál, Rockville, Maryland, Egyesült Államok. 1. példa Alfa-amiláz gént és antibiotikum rezisztencia markert tartalmazó plazmidok készítése. Alfa-amiláz gént tartalmazó teljes DNS készletet izolálunk B. stearothermophilus ATCC 31 783 törzs sejtjeiből, Berns és Thomas általános módszere szerint (J. Molec Bioi. 11, 476-490(1965)). A jelen eljárásban a sejteket tris-(hidroximetil)-amino metán-hidrok lóridra 50 mmólos (a továbbiakban Tris-HCI) (pH 8) puffer etilén-diamin-tetraecetsavra 0,6 mmólos ( a továbbiakban EDTA) és szacharózra 25 %-os keverék' ben szuszpendáljuk, a standard konyhasós cifrát helyett 1 óránátO'C-onlizozimmal(2 mg/ml) kezeljük emésztés előtt Az eljárásban felhasznált pBR 322 DNS, a Hind III restrikciós enzim és a T4DNS ligáz a Bet hesda Research Laboratories (Bethesda, Maryland, Egyesült Államok) termékei. 7,5 mikrogramm S. stearothermophilusbó\ nyert teljes DNS, 7 egység Hind III restrikciós enzim és 10 mikrogramm bovin szérumalbumin 100 mikroliter, NaCI-re 50 mmólos, Tris-HCI-re 6 mmólos (pH 7,5) és MgCl2-re 6 mmólos oldatban képzett keverékét 37'C-on 30 percen át inkubáljuk 2,2 mikrogramm pBR 322 plazmid DNS-t és 7 egység Hind lll-t 20 mikroliter fent leírt oldatban 1 órán át 37"C-on emésztünk. A DNS analízise agaróz gélen megmutatja, hogy az emésztés teljessé vált. Ezután 6,75 mikrogramm emésztett B. stearothermophilus DNS-t és 1,8 mikrog ramm emésztett pBR 322 DNS-1 összekeverünk 0,3 ml, Tris-HCI~re 66 mmólos (pH 7,6), MgCb-re 6,6 mmólos, ditiotreitolra 10 mmólos és adenozin-trifoszfátra 0,067 mmólos oldatban, és összekapcsoljuk T4DNS ligáz segítségével A kapcsolás után a DNS analízise agaróz gélen mutatja ki, hogy a kapcsolás teljes, és kimutatható mennyiségben nincs maradék lineáris pBR 322 DNS. 2. példa Alfa amiláz gént és antibiotikum reziszten^ cia markert tartalmazó plazmidok transzformálása E. coli- ba. E. coli RBi (amely PRC 399 törzs néven all rendelkezésre a Plasmid Reference Centerben, Stanford University Medical Center,. Stanford, Kalifornia, Egyesült Államok) törzsek tenyészetét a következő összetételű tápközegben nö vesztjük g/liter 6 Tripton 10,0 Élesztőkivonat 5,0 Nátriumklorid 5,0 Glükóz 1,0 193516 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
