193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 A tenyészetet egy éjszakán át kémcsőben növesztjük 37‘C-on. Ez után 9 rész azonos összetételű tápközeggel hígítjuk, és 37°C-on to* vábbi 135 percen át inkubáljuk élénk rázás mellett A sejteket centrifugálással kinyerjük, és hideg, 0,1 mólos NaCI oldattal mossuk. Az így nyert sejteket a transzformációhoz előkészítjük, Cohen és munkatársainak kalciumkloridos módszerével (Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., 69, 2110-2114 (1972)). Az 1. példa szerint készített, összekapcsolt DNS egyik felét transzformáljuk £. coli RRi sejtbe A sejteket ugyanolyan táptalajt tartalmazó lemezen tenyésztjük, mint amilyenen az £. coli sejtek nőttek, azzal a kivétellel, hogy a táptalaj ampicillint is tartalmaz 50 mikrogramm/ml koncentrációban Ezáltal csak azok az E. coli sejtek jelennek meg, amelyek tartalmazzák az ampicillin rezisztencia génnel rendelkező pBR 322 plazmidot A rekombináns DNS-t tartalmazó sejtek számának meghatározása érdekében az ampicillin-rezisztens sejteket ellenőrizzük tetraciklin rezisztenciára Mivel egy DNS darab beiktatása pBR 322-be a Hinü III elhasítási helynél általában inaktiválja a plazmid tetraciklin rezisztencia génjét, a tetraciklin érzékenység gyakorisága megadja a sejt populációban jelenlevő rekombináns DNS-t tartalmaz^ sejtek számát. A transzformáció után 3,6 . 104 ampicillin rezisztens sejt és 3,0 10 tetraciklin rezisztens sejt keletkezik milliliterenként Tehát a sejtek mint egy 16 %-a érzékeny tetraciklinre, ezek rendelkeznek a rekombináns DNS-t tartalmazó plazmiddal 3. példa Alfa-amiláz termelő E. coli telepek izolálása Az E. coli növesztéséhez használt összeté telű tápközeget készítjük el, azzal a kivétellel, hogy 15 g/l agart és 50 mikrogramm/ml ampicillint is adunk hozzá. A tápközeget 130 petricsészéb.e helyezzük el és inokuláljuk a 2 példa szerint előállított transzformált E.coli hígított tenyészetével. Átlagban 113 telep keletkezik lemezenként. A telepeket addig hagyjuk nőni, amíg 1 -2 mm átmérőjűek lesznek, majd replika módszerrel átvisszük a következő összetételű tápközegre: g/liter 7 Na2HP04 6 KH2PO4 3 NaCI 0,5 NH4CI 1 Elesztőkivonat 1 Pepton 10 Agar 15 Lintner féle keményítő 10 A növekedés 3 órájában T4 bakteriofágot amely ATCC 11303-B4 számon áll rendelkezésre — rétegezunk rá a keményitőtartalmú lemezre Mintegy 1 107 T4 et alkalmazunk lemezenként, hogy bekövetkezzék a novekvőf .co// sejtek lízise, és ilyen módon felszabaduljanak az intracelluláris enzimek Egy éjszakán át tartó növesztés és lízis után 2,5 %-os Lugoi jódoldatot öntünk a lemezekre, hogy kimutassuk az amiláz-aktivitás által termelt világos zónákat. A jelenlévő mintegy 15 000 telepből 18 telep termel világos zónákat, jelezve az amiláz jelenlétét. Az amiláz aktivitást mutató telepeket replika módszerrel átvisszük egy másik lemezre, és ismét elvégezzük az amiláz aktivitás mérést. Az amiláz aktivitás azonban csak a sejt lízisét elősegítő T4 hozzáadása után jelentkezik, jelezve, hogy az amiláz intracellulárisan termelődik. Más kísérletekben kimutatható, hogy a D- cikloszerín éppen olyan hatásosan idézi elő a sejtek lízisét, mint a T4, ha a D-cikloszerint 600 mikrogramm/ml koncentrációban használjuk táptalaj felülrétegezésére. Az amiláz génnel rendelkező pBR 322 vek tort tartalmazó E. coli törzs ATCC 31789 számon áll rendelkezésre 4. példa Alfa-amiláz gént és antibiotikum reziszten cia markert tartalmazó plazmidok átvitele egy másik E. coli törzsbe. E. coli C 600 törzs (ATCC 23 724) tenyészetét növesztjük, a sejteket kinyerjük, és a 2. péb da szerint előkészítjük a transzformációhoz A 3. példa szerint nyert öt különböző amiiáz kiónt növesztünk, és a rekombináns plazmidokat Clewell és Helinski standard derített lizátum módszerével (Biochemistry, 9, 4428-4440 (1970)) vonjuk ki A részben tisztított plazmid DNS-t Tris HCI-re 10 mmólos, EDTA-ra 1 mmólos keverékben (pH 7,5) szuszpendáljuk, mielőtt átvisszük CaCl2-ve! kezelt E. coli sejtek be. A DNS szuszpenziót sterilitási vizsgálatnak is alávetjük, hogy olyan telepek ne zavarják a képet, amelyek esetleg a DNS-el együtt bekerült idegen sejtek amiláz aktivitását mutatják. A transzformáit sejteket ampicillintartalmú táptalajon növesztjük, hogy csak azok a sejtek legyenek képesek nőni, amelyek a plazmidot tartalmazzák. Miután a telepeket amiláz-aktivitásra megvizsgáltuk 100 %-os korreláció áll fenn a plazmid jelenléte és az amiláz-aktivitás között. Ilyen módon a plazmid DNS-ről ki tudjuk mutatni, hogy képes transzformálódni mindkét E coli törzsbe, amiláz-termelővé téve azokat, vagyis azt tudjuk kimutatni, hogy a jelenség nem a törzstől függ, hanem rekombináns plazmid szükséges hozzá. Az amiláz génnel rendelkező pBR 322 plazmid vektort tartalmazó E. coli törzs az ATCC 31 788 számon áll rendelkezésre. 5 példa Az alfa-amiláz hőstabilitása Négy, a 3 példa szerint előállított amiláz kiöntés kontrollként £ coli RRi tenyészetet növesztünk 15 ml, a 2. példában alkalmazón tápközegben A sejteket lizáljuk D-cikloszerin hozzáadásával, majd a sejtmaradékot centrífugálással eltávolítjuk A felülúszóhoz nátriumacetátot és kalciumkloridot adunk 50 mmól, illetve 2,5 mmól koncentráció eléréséig, és a pH t 6,0 ra állítjuk be Az enzimoldatot csavaros kupakkal ellátott kémcsőbe helyezzük, amelyet 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
