193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
5 193512 mertetjük: Az alkalmazott mikroorganizmusok Munkánk során két mikroorganizmus törzset használtunk: Escherichia coli x 1776 [amelyet a 4 190 495 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek] és Escherichia coli K 12 294 (A végződés, thi", hsr", hsmk') [amelyet a 2 055 382A sz nagybritanniai publikált szabadalmi bejelentésben ismertetnek | Mindkét törzs az American Type Culture Collection mikroorganizmus-gybjteményben lett deponálva ATCC 31537, illetve 31446 számon, 1979. július 3 án, illetve 1978. október 28. án Az összes DNS rekombinációs kísérletet az Amerikai Egyesült Államokban lévő National Institutes of Health által megadott idevágó irányelvekkel összhangban végeztük. Jóllehet a találmány szerinti eljárás különösen előnyös változatainál az Escherichia coli 1776 és az Escherichia coli K-12 294 törzset használtuk, azonban más ismert Escherichia coli törzs is alkalmazható, például az Escherichia coli B vagy egyéb mikrobatörzsek, amelyek közül számos deponálva van és beszerezhető az ismert mikroorganizmus-gyűjteményektől, mint amilyen az American Type Culture Collection. Lásd ezzel kapcsolatban az ATCC katalógust és a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsájtási iratot. A LelF hibrideknek a találmány szerinti előállítása során az egyes kiindulási génekben egyformán elhelyezkedő restrikciós endonukleáz hasítási helyeket és a gén-végeket hasznosítjuk a hordozó expressziós plazmidok (vektorok) hasonló helyeivel kapcsolatban. Például a pLelF A trp 25 expressziós plazmid Xba I és Pst I közötti nagy feltárási töredéket (mintegy 3900 bázispárból áll) összekapcsolhatjuk különböző kiindulási leukocita interferon gének Xba I és Pvu II közötti, valamint Pvu II és Pst I közötti feltárási töredékeivel, és ekkor olyan expressziós plazmidokat kapunk, amelyek segítségével a megfelelő hibrid leukocita interferonhoz jutunk. Az egyes LelF expressziós plazmidokat egymástól függetlenül állítottuk elő különböző plaz midokból [például pLelF A trp 25, pLelF B trp 7, pLelF C trp 35, pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF G, pLelF H, pLelF I stb., amelyek kialakítását a Nature, 287, 411 (1980) szakcikk tárgyalja] vagy a pBR322 plazmidból [amelynek az előállítását a Gene,2\ 95 (1977) szakcikk ismerteti] elkülönített hasítási töredékekkel A fenti plazmidok némelyikénél a „trp" jelölés triptofán promotor-operátor rendszert jelent, amely igen előnyösen alkalmazható a bakteriális úton történő termeléshez, amint azt a 36 776 sz közzétett európai szabadalmi bejelentés ismerteti. Egy első érett leukocita interferon közvetlen kifejeződése A LelF A interferon érett interferon polipeptidként történő közvetlen kifejeződését célzó eljárás során szintetikus (N-terminális) és kiegészítő dezoxiribonukleinsavakal kapcsoltunk össze Egy Sau 3a restrikciós endonukleáz hely cél szerűen a LelF A 1. és 2. kodonja között található. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot választottunk ki, amelyek ATG lefordítást kiváltó kodont tartalmaznak, helyreállítják az 1. számú aminosavat (cisztein) kódoló kodont és EcoRl „tapadós” (sticky) véget hoznak létre. Ezeket az oligomereket a pL31 plazmid 34 bázispárból álló, Sau 3a és Ava II közötti töredékéhez kapcsoltuk. A képződött, 45 bázispárból álló terméket két további DNS töredékhez kapcsoltuk. Ilyen módon egy 865 bázispárból álló, szintetikus (természetes eredetű hibrid gén képződött, amely a LelF A-t kódolja, és amely az Eco RI es Pst I restrikciós helyekkel van határolva Ezt a gént beillesztettük a pBR322 plazmidba az Eco és Pst I helyek közé így a pLelF A 1 plazmidot kaptuk. A pGM1 plazmid tartalmazza az Escherichia coli triptofán operont, amely a ALel413 törlést foglalja magába [Miozzari és munkatársai, J Bacteriology, 133, 1457-1466 (1978)], ennek következtében olyan összekapcsolt fehérjét fe jez ki, amely tartalmazza a trp vezető első 6 aminosavját és a trp E polipeptidnek mintegy utolsó harmadát (ez a továbbiakban Le’ jelöléssel szerepel), valamint az egész trp D polipeptidet. Az egész összekapcsolt fehérje kifejeződése a trp promotor-operátor rendszer irányítása alatt történik. 20 |xg pGM1 plazmidot kezeltünk a Pvu H restrikciós enzimmel, amely öt helyen hasítja a plazmidot. A géntöredékeket ezután EcoRl összekapcsolókkal kapcsoltuk össze (ezek egy pCATGAATTCATG szekvenciájú ónkiegészítő oligonukleotidból állnak), és így egy EcoRl ha sítási hely jött létre, amelyet később egy EcoRl helyet tartalmazó plazmidba lehetett klónozni A pGM1 plazmidból nyert 20 ^.g mennyiségű DNS töredéket 10 egység T4 DNS-iigázzal kezeltük 200 pikomól mennyisegű, az 5 végén foszforilezett szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 pul T4 DNS-ligáz pufferoldat [összetétele: 20 mM trisz, pH=7.6; 0,5 mM adenozin-trifoszfát, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM ditiotreitol] jelenlétében, 4 C - on, egy éjszakán át. (A trisz jelentése trisz(hidr oxi-metil)-amino-metán.) Az oldatot ezután 10 percig hevítettük 70“C-on az összekapcsolás megállítása céljából Az összekapcsolókat EcoRI-vel lehasítottuk, és a töredékeket — amelyek most EcoRl végeket tartalmaztak — szétválasztottuk 5% os poliakrilamidgéllel végzett elektroforézissel (PAGE). A három legnagyobb töredéket különítettük el a gélről úgy, hogy először etídium-bromiddal megfestettük, ultraibolya fénnyel történő megvilágításnál a töredékek elhelyezkedését meghatároztuk, és levágtuk a gélből az elkülöníteni kívánt anyagot tartalmazó részeket. Az egyes géntöredékeket tartalmazó gélda rabokat 300 jxl 0,1xTBE pufferoldattal együtt dializáló zsákba helyeztük és 1 órán at vegez tünk elektroforézist 100 V feszültséggel 0,1 xTBE pufferoldatban (a TBE pufferoldat összetétele? 10,8 g trisz bázis, 5,5 g bórsav és 0,09 g etilen 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
