193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
193512-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó 1 liter vízben). A dializáló zsákból a vizes oldatot eltávolítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk és 0,2 M nátrium klorid-koncentrációt állítottunk be. A DNS-at etanolos kicsapással nyertük ki a vizes közegből. A trp promotor-operátor rendszert tartalmazó, EcoRI ta pados végekkel ellátott gént az alábbiakban ismertetett módon azonosítottuk. A töredékeket tetraciklinre érzékeny plazmidba illesztettük, amely a promotor-operátor beillesztése után ellenállóvá vált a tetraciklinnel szemben. A pBRH1 plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267-3287 (1979)] ampicillinnel szembeni rezisztenciát hoz létre, és tartalmazza a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, azonban ehhez kapcsolódó promotor hiányában nem hozza létre ezt a rezisztenciát. Ennek megfelelően a plazmid érzékeny tetraciklinre. Ha beviszünk egy promotor-operátor rendszert az EcoRI helyre, a plazmid rezisztenssé válik tetraciklinnel szemben. A pBRH1 plazmidot EcoRI enzimmel hasítottuk, és az enzimet fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval eltávolítottuk. A terméket etanolos kicsapás után vizes közegből nyertük ki. A DNS molekulát a fenti három DNS töredék mindegyikével összekapcsoltuk, és az előbbiekben ismertetett módon T4 DNS ligázzal kapcsoltuk össze A reakcióelegyben jelenlévő dezoxiribonuklelnsavat felhasználtuk a megfelelő Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálására [Backman és munkatársai, Proc. Natl. Acad., Sei. USA, 73, 4174-4198 (1976)], a szokásos módszerekkel [Hershfield és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 3455-3459 (1974)]. A baktériumokat LB (Luria-Bertani) lemezekre vittük fel, amelyek 20 |xg/ml ampicillint és 5 jxg/ml tetraciklint tartalmaztak. Néhány, tetraciklinre rezisztens tenyészetet kiválasztottunk, a plazmid DNS-at elkülönítettük, és a kívánt töredék jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. A kapott plazmid jelölése: pBRHtrp. A hepatitisz B vírus genóm EcoRI és BamHI enzimekkel a szokásos módon kapott hasítási termékét a pGH6 plazmid EcoRI és BamHI helyeibe klónoztuk [Goeddel és munkatársai, Nature 287,(1979)j. Ekkora pHS32 plazmidot kaptuk. Ez utóbbit Xbal enzimmel hasítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, és a terméket etanollal kicsaptuk. Ezután 1 ^l Escherichia coli polimeraz I Klenow-töredékkel (Boehringer-Mannheim) kezeltük 30 |xl polímeráz pufferoldatban (összetétele: 50 mM káliumfoszfát, pH^7,4,7 mMmagnézium-klorid, 1 mM beta-merkapto-etanol), 0,1 mMdTTPésO,1 mM dCTP jelenlétében, 30 percig 0“C-on, majd 2 órán át 37 C-on. E kezelés hatására az Xbal hasítási hely 5’-nél túlnyúló végénél lévő 4 kiegészítő nukleotid közül 2 belép a 3’ véghez: 5’ CTAGA— ______ 5’ CTAGA — 3’ T — 3’ TCT — 7 Két nukleotid, dC és dT, beépült, és az 5’ végződésnél ekkor két túlnyúló nukleotid ma radt. A pHS32 plazmidnak ezt a lineáris mara dékát (fenolos és kloroformos extrakció, majd vízben etanolos kicsapással történő kinyerés után) EcoRI enzimmel hasítottuk. A nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél elektroforézissel választottuk el a kisebb EcoRI Xbal töredéktől, és elektroelúcióval elkülönítettük Ezt a pHS32 plazmidból származó, 0,2 p.g mennyisé gű DNS töredéket a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között a pBRHtrp plazmidból készített triptofán operon mintegy 0,01 jig menynyisógü EcoRI Taql töredékével kapcsoltuk össze A pHS32 plazmid töredékét az EcoRI Taql töredékhez kapcsoló eljárás során a Taql túl nyúló véget kapcsoljuk az Xbal megmaradt túl nyúló véghez, jóllehet nem áll fenn tökéletes Watson-Crick bázispárosítás: —1T CTAGA—___ —TCTAGA — —AGC TCT— —AGCTCT -Ennek az összekapcsoló reakcióelegynek egy részét Escherichia coli 294 törzs sejtjeibe transzformáltuk, hőkezeltük és ampicillint tartalmazó LB lemezekre vittük át. 24 tenyészetet választottunk ki, 3 ml LB táptalajon szaporítottuk, és a plazmidot elkülönítettük. Hat esetben tapasztaltuk azt, hogy az Xbal hely regenerálódott az Escherichia coli által katalizált DNS párosítás és reprodukció útján: —TCTAGA— -TCTAGA -—AGCTCT- —AGATCT— Ezek a plazmidok mind EcoRI, mind pedig Hpal enzimmel hasíthatok, és a várt restrikciós töredéket szolgáltatják. Az egyik pTrp 14 jelzé sű plazmidot felhasználtuk heterológ polipepti dek termelésére az alábbiakban ismertetett mó don. A pHGH plazmid [Goeddel és munkatársai Nature, 281,544 ( 1979)] az emberi növekedési hormonra vonatkozó gént tartalmaz, amely szintetikus DNS töredékekből származó 23 aminosav kodonból és 163 olyan aminosav kodonból áll, amely kiegészítő DNS-ból képződött az emberi növekedési hormon üzenethordozó RNS fordított átírása útján. Ez a gén, jóllehet hiány zanak belőle az emberi növekedési hormon „elő” szekvenciájának kodonjai, tartalmaz egy ATG lefordítást beindító kodont A gént ^0 pHGH 107 plazmidból különítettük el EcoRI enzimmel végzett kezeléssel, majd Escherichia coli DNS polimeráz I Klenow töredékkel, dTTP vei és dATP-vel végzett kezeléssel, a fentebb tárgyalt módon. Fenolos és kloroformos extrakció, s etanolos kicsapás után a plazmidot BamHI enzimmel kezeltük. Az emberi növekedési hormon (HGH) gémet tartalmazó töredéket poliakrilamidgél eiektro forézissel, majd elektroelúcióval különítettük el A kapott DNS töredék a tetraciklinnel szembe ni rezisztenciát biztosító szerkezeti gén első 350 nukleotidját is tartalmazza, azonban hiányzik belőle a tetraciklin promotor operátor rendszer, 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
