193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
roncsolják és megfelelő tisztítást alkalmaznak a többi baktériumfehérje eltávolítására A különféle leukocita interferonokat kódoló gének nukleotidszekvenciájának vizsgálata azt mutatja, hogy bizonyos fokú azonosság áll fenn közöttük az egyes restrikciós endonukleázok által felismert hasítási helyek jelenlétét és elhelyezkedését illetően. Azt találtuk, hogy ezt az azonosságot felhasználhatjuk új hibrid gének DNS-rekombinációval történő előállítására, s e gének irányításával olyan hibrid leukocita interferonokat termelhetünk mikrobiológiai úton, amelyek várhatóan rendelkeznek kisebb vagy nagyobb mértékben az eredeti gének által kódolt vírusellenes és egyéb, az interferonokra jellemző tulajdonságokkal. A kiindulási leukocita interferon gének •— amelyek az említett leukocita interferon fehérjéket kódolják — természetes alléles eltéréseket mutatnak Ezeket az alléi változatokat az jellemzi, hogy egy vagy több aminosavban eltérnek egymástól a fehérjeszekvenciák, vagy a szekvenciában egy vagy több aminosavat érintő törlés, helyettesítés, beillesztés, inverzió vagy kiegészítés található. Minden egyes kiindulási leukocita interferonnál — jelölésük LelF A, LelF B... LelF J stb — a jelölés vagy défini ció, s ennek következtében a találmány is, ezekre az alléi változatokra is kiterjed.. Az ábrák leírása: Az 1. ábrán nyolc leukocita interferon (LelF) kiegészítő DNS (cDNS) kiónjainak kódoló tartományai nukleotíd szekvenciáját mutatjuk be. Közülük az egyik, amelyet LelF E jelöléssel láttunk el, látszólag pszeudogén, amely nem kódol aktív leukocita interferont, míg egy másik a LelF G jelölésű nem tartalmazza a megfelelő interferon teljes szekvenciáját Minden egyes leukocita interferonnál aláhúztuk az ATG lefordításbeindító kodont valamint a lezáró triplettet. A 2. ábra nyolcféle LelF típussal klónozott kiegészítő dezoxiribonukleinsavak (A-H) restrikciós endonukleáz enzimekkel történő feltárással kapott összetételét szemlélteti. A klóno-. kát tartalmazó plazmidokat.a dC:dG farokképző módszerrel hoztuk létre [Goeddel és munkatársai, Nature, 287, 411-416 (1980)] A cDNS beillesztéseket Pst I enzim alkalmazásával hasíthatjuk, azaz mindegyik beillesztés mindegyik vége Pst l restrikciós endonukleáz hasítási hely. Az egyes cDNS beillesztések végén található vonalak a szegélyező homopolimer dC:dG farkakat jelentik. Jeleztük a Pvu II, Eco Rl és Bgl II restrikciós helyek elhelyezkedéséi Az ábra pontozott részei a-z érett leukocita interferonok kódoló szekvenciáinak felelnek meg, a vonalkázott részek pedig a jel—pepticJ kódoló szekvenciáit jelképezik. Az üresen hagyott részek a 3 és 5’ nem-kódoló szekvenciákat mutatják. A 3. ábrán a nukleotíd szekvenciák alapján meghatározott nyolc LelF fehérje-székvenciá kát hasonlítjuk össze Azokat az egybetüs rövidítéseket használjuk, amelyeket a IUPAC-IUB biokémiai nomenklatúrával foglalkozó bizottsága ajánl: 3 A(alanin), C(cisztein), D(aszparaginsav), E(glutaminsav), F(fenii-alanin), G(glicin), H(hisztidin), l(izoleucin), K(lizin), L(leucin), M(metionin), N(aszparagin), P(prolin), Q(glutamin), R(arginin), S(szerin), T(Treonin), V(valin), W(triptofán) és Y(tirozin). A számok az aminosavak helyzetére vonatkoznak (S a jel pepiidre vonatkozik). A 165 aminosavból álló LelF A szekvenciában a 44-es helyzetbgn található vízszintes vonal szerepe az, hogy összevethető legyen a LelF A szekvencia a többi LelF 166 aminosavból álló szekvenciáival. A LelF E szekvencia meghatározásánál figyelmen kívül hagytuk a kódoló tartományában lévő külön nukieotidot (187-es helyzetben az 1. ábrán). A csillagok fázison belüli lezáró kodonokat jelölnek. Olyan aminosavak is láthatók, amelyek valamennyi LelF-ben megtalálhatók, a pszeudogén LelF E kivételével. Az aláhúzott maradékok olyan aminosavak, amelyek az emberi fibroblaszt interferonban is jelen vannak. Az 1 ábrán szereplő 11 és 69 közötti nukleotidok a 3. ábrán feltüntetett S1-S23 aminosa vaknak felelnek meg. Az 1 ábrán szereplő TGT kodon (70 72 nukleotíd) a 3 ábrán látható ciszteinnek (C, 1 aminosav) felel meg. A 3 ábrán a Pvu II restrikciós endonukleáz hasítási hely a 92. és 93. aminosavra vonatkozó kodonok között helyezkedik el a LelF A, B, D, F és G esetén, azaz az 1 ábrán lévő 346. és 347. nukleotíd között A 4. ábrán az A és D érett leukocita interfe ron aminosav-szekvenciáit hasonlítjuk össze szaggatott vonalakkal jelölve a 44 aminosav törlését a LelF A-nál. A LelF D-nek csak azon aminosavjait tüntettük fel, amelyek eltérnek a LelF A megfelelő aminosavjaitól, a LelF D aminosav-szekvenciája egyébként azonos a LelF A aminosav-szekvenciájával. A 4 ábrán a Bgl II és Pvu II restrikciós endonukleáz hasítási helyének viszonylagos helyzetét is feltüntettük a megfelelő génen (e hasítási helyeket felhasználjuk a találmány szerinti előnyös hibrid leukooL ta gének kialakításához). Az 5. és 6. ábrán azokat az eredményeket mutatjuk be, amelyeket egy találmány szerinti előnyös hibrid leukocita interferon (LelF-A/D) összehasonlító vizsgálatánál kaptunk . A vizsgalatok során az enkefalomiokarditisz vírussal (EMC), illetve a veszikuláris sztomatitisz vírussal (VSV) szembeni aktivitást határóztuk meg egér sejteken. A 7. és 8. ábrán azokat az eredményeket mutatjuk be, amelyeket a LelF A/D interferonnal EMC vírusfertőzéseknél végzett összeha sonlíto vizsgálatoknál kaptunk egéren, illetve hörcsögön. A 7. ábrán feltüntetett adatok 3 óra val a megfertőzés előtti i.p. kezelés eredményei A LelF A/D és LelF A interferonokból megadott dózisok WISH sejteken végzett titráláson alapul nak A 9 ábra öt leukocita interferon fehérje Közöttük az I és J típusok DNS szekvenciáit tartalmazza A találmányt az alábbiakban részletesen is 4 3 193512 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
