193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 A kívánt fehérje tisztított messenger (küldönc-) RNS (mRNS) templátja egyszálú DNS -kópiájának (cDNS) előállítása; a cDNS konvertálása kettősszálú DNS-sé; a DNS kapcsolása valamely alkalmas klónozás-hordozó megfelelő helyéhez, a rekombináns DNS molekula kialakítása céljából; valamely alkalmas gazda átalakítása ezzel a rekombináns DNS molekulával. Ez az átalakítás lehetővé teheti, hogy a gazda azután a kívánt fehérjét termelje, fgy már többféle nem-bakteriális gént és fehérjét állítottak elő E. coli baktériumokban a rekombináns DNS-technika segítségével. Ezek sorában példaképpen megemlíthető az a-interferon [S. Nagata és munkatársai: „Synthesis in E, coli of a Polypeptide with Human Leukocyte Interferon Activity", Nature, 284, 316—320 (1980)]. Emellett a rekombináns DNS-technifcát alkalmazták egy oly plazmid előállítására is, amely a közlések szerint egy a ß-interferont kódoló gén-szekvenciát tartalmaz [T. Taniguchi és munkatársai: „Construction and Identification of a Bacterial Plasmid Containing the Human Fibroblast Interferon Gene Sequence”, Proc. Japan Acad. Ser. B, 55, 464— 469 (1979)]. Azonban a fenti munkák egyikében sem írták le a ß-interferon tényleges gén-szekvenciáját és egyikben sem hasonlították össze ezt a szekvenciát egy autentikus ß-interferon kezdeti aminosav-szekvenciájával vagy aminosav-összetételével. Az előbb idézett munka csak a-interferonra irányult, amely az interferonok I. osztályába (lásd fentebb) tartozó, kémiailag, biológiailag és immunológiailag a ß-interferontol különböző termék. Az utóbb idézett munka kizárólag hibridizációs adatokon alapul. Ezek az adatok egymagukban nem teszik lehetővé annak megállapítását, hogy a kiválasztott klón tartalmazza-e a ß-interferont kódoló teljes vagy tényleges gén-szekvenciát, vagy hogy a klónozott gén-szekvencia képes lesz-e ß-interferont létrehozni baktériumokban. A hibridizáció csak azt állapítja meg, hogy valamely adott DNS-betét bizonyos fokig homológ és komplementer annak a poli (A) RNS-nek valamely mRNS-komponensével, amely oocitákba injektálva interferon-aktivitást vált ki. Emellett az esetleges homológja mértéke függ az adott szűrési (szkrin) eljárásban választott hibridizálási feltételektől. Ezért a poli (A) RNS mRNS-komponensének hibridizálása egymagában nem bizonyítja azt, hogy a választott DNS-szekvencia olyan, hogy kódolja a humán ß-interferont vagy valamely a humán ß-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató fehérjét, vagy pedig hogy egy ilyen szekvencia hasznos lehet ilyen polipeptidek megfelelő gazdákban történő előállításának céljaira. Egy Zürichben 1980. február 25-én tartott szemináriumon Taniguchi kijelentette, hogy neki sikerült meghatározni az ő hibridizáló kiónjainak egyike esetében a nukleotid-szek-7 venciát. Megállapította azt is, hogy az említett szekvencia által kódolt első 13 aminosav azonos volt azzal a szekvenciával, amelyet Knight és munkatársai fentebb idézett munkájukban az autentikus humán ß-interferonra közöltek. Taniguchi nem közölte a kiónjának teljes nukleotid-szekvenciáját és nem is hasonlította össze annak aminosav^összetételét az autentikus humán ß-interferonra vonatkozólag meghatározott aminosav-összetétellel. Azóta Taniguichi közölte hibridizáló kiónjának teljes nukleotid-szekvenciáját [T. Taniguichi és munkatársai: Gene, 10, 11 — 15 (1980)]. Ez a szekvencia egyetlen nukleotidban különbözik az 1980. április 3-án benyújtott 8 011 306 sz. brit szabadalmi bejelentésben leírt és igényelt szekvenciától (ennek a brit szabadalmi bejelentésnek az elsőbbségét igényeljük jelen bejelentésünkhöz). A Taniguichi által közölt aminosav-szekvencia azonos az előző bejelentésben igényelt és leírt szekvenciával. Taniguichi nem írta le az 1980. június 6-án benyújtott 8 018 701 sz. brit szabadalmi bejelentés (ennek a bejelentésnek az elsőbbségét is igényeljük a jelen bejelentésünkhöz) idején a humán ß-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptideknek valamely alkalmas hordozóban való expresszióját. A jelen találmányt éppen ez jellemzi, nevezetesen a humán ß-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptid (ek) valamely gazdában való expressziója, valamint az erre vonatkozó módszerek és az ebben szereplő polipeptidek, gének és rekombináns DNS molekulák. A jelen találmánynak nem célja, hogy tiszta vagy lényegileg tiszta a-interferon mRNS- jét állítsa elő, mielőtt megkísérli az interferon-génnek a klónozását vagy fibroblaszt interferon-szerű polipeptideknek valamely gazda-baktériumban való előállítását, amint ezt a Research Disclosure No. 18309, 361—362 (1979) javasolja. Végéül fel kell ismerni, hogy valamely a poli (A) RNS-ből valamely, az oocitákban humán interferon-aktivitást termelő mRNS-t hibridizáló DNS-szekvenciának a kiválasztása vagy ilyen rekombináns DNS molekulának a felépítése még nem elegendő annak kimutatására, hogy az illető DNS-szekvencia vagy a rekombináns DNS molekula hibrid beillesztése megfelel a humán interferonnak. így, az adott DNS-szekvenciát kódoló aminosav-szekvenciának az autentikus fehérje aminosav-szekvenciájával való összehasonlítása nélkül csak egy a humán interferon immunológiai és biológiai aktivitását mutató polipeptidnek a termelése bizonyíthatja be ténylegesen azt, hogy a választott DNS-szekvencia, illetőleg a felépített rekombináns DNS molekula valóban megfelel a humán interferonnak. Még fontosabb utalni arra, hogy csak a választott DNS-szekvenciának, illetőleg felépített rekombináns DNS molekulának vagy ezzel rokon szekvenciáknak 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
