193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 ló kezelés időtartamának és körülményeinek a változtatása útján oly DNS-fragmensek egész sorát állítottuk elő, amelyek különböző számú nukleotldot tartalmaznak az érett HuIFN-ß AUG start-kodonját megelőző és a HuIFN-ß szignál-peptidre kódoló szekvenciából (amennyiben egyáltalán tartalmaznak ilyen nukleotidokat). Ezeket a íragmenseket azután úgy manipulálhatjuk, hogy riboszómás kötési helyeket szerkesszünk meg különböző távolságokra a start-kodontól és ezzel létrehozzuk a kívánt szekunder struktúrát e kodon közelében, hogy ezzel elősegítsük az érett HuIFN-ß expresszióját. Az endonukleázzal kezelt íragmenseket E. coli DNS-polimeráz I enzimmel (KJenow-fragmens dATP és dGTP jelenlétében történő kezelés útján tompavégüekké alakítottuk át, hogy kitöltsük az esetleg kiálló 5’-végeket. Ezután egy kétszálas Xhol összekötőtagot, amely az 5’-CCTCGAGG-3’ szekvenciát tartalmazta (Collaborative Research), kapcsoltunk a tompavégű DNS-fragmensekre. Ezeket a íragmenseket ezután egy kétszálas EcoRI kapcsolótaggal toldottuk meg, amely az 5’-CCGAATTCGG-3’ szekvenciát tartalmazta (Collaborative Research). EcoRI enzimmel való kezelés után a „ragadós" EcoRI végeket tartalmazó íragmenseket recirkularizáltuk E. coli DNS-ligázzal. E ligáznak a T4 DNS-ligáz helyett való használata révén elkerüljük a tompavégű fragmensek recirkularizációját. Egy plazmidot választottunk ki és ezt pPLa -HFIF-67-12A19 BX-2 plazmidnak neveztük el. Ennek egy Xhol helye van, körülbelül 25 bázis-párral az érett HuIFN-ß AUG start-kodonja előtt. Az Xhol helyet megelőzi egy EcoRI hely is, amelyet a Hpal fragmens EcoRI kapcsoló tagjának a pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid £ promotorját éppen megelőző EcoRI helyhez történt kapcsolása hozott létre. Ezért a p-laktamáz-kódoló szekvencia kiiktatásra került. Továbbá, minthogy a HuIFN-ß szignál-szekvenciának legalább egy részét eltávolítottuk, csakis érett HuIFN-ß expressziója lehetséges. E. coli K12AHI-t transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 plazmiddal. A baktériumok által termelt HuIFN-ß elkülönítése és jellemzése A) Baktérium-kivonatok készítése 1. Indukciós eljárás 50% glicerin és 50% LB közeg elegyében —80°C hőmérsékleten megíagyasztott törzs-kultúrákból, közöttük a fent leírt IFN-ß fragmenseket tartalmazó plazmidokkal transzformáit K12AHI és M5219 törzsek kultúráiból vett alikvot részeket a kívánt antibiotikumot tartalmazó friss LB közegre oltottunk és 28°C hőmérsékleten telítődésig szaporítottuk a kultúrákat. Antibiotikumot nem tartalmazó LB közeg két 500—500 ml-nyi adagját 51 a telített sejt-tenyészetek 1 — 1 ml-jével oltottuk be és élénk rázás közben 28°C hőmérsékleten tenyésztettük őket 2,108/ml sejt-sűrűségig. Az egyik adagot 42°C hőmérsékletre emeltük és tovább ráztuk. Az alkalmazott plazmidtól függően a kultúrát a 42°C-ra való hőmérséklet-emelés után különböző időkben gyűjtöttük be. A mindvégig 28°C hőmérsékleten tartott kontroli-kultúrát ugyanakkor gyűjtöttük be, amikor a 42°C-on tartott kultúrát. A sejteket egy GSA rotorban (Sorvall) percenként 8000 fordulattal 10 percig történő centrifugálással gyűjtöttük össze. A szilárd üledéket 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =7,4) és 30 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldat 20 ml-jével mostuk, majd egy SS34 rotorban (Sorvall) újra centrifugáltuk, 10 pecig, percenként 10 000 fordulattal. A szilárd üledéket szárazjég-metanol keverékkel gyorsan megfagyasztottuk és —80°C hőmérsékleten tároltuk. Olyan esetekben, amikor az összegyűjtött sejteket ozmózisos sokknak kívántuk alávetni, ezt a fagyasztási műveletet mellőztük. A baktériumok líziáére és extrahálására két különböző eljárást alkalmaztunk. 2. Extrakciós eljárások „A" lízis A sejteket a fent ismertetett pufferoldat összesen 4 ml térfogatában újból szuszpendáltuk és lizozim (Sigma) enzimet adtunk hozzá 1 mg/ml koncentrációig, majd 0°C hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Ezután a szuszpenziót két megfagyasztási-íelolvasztási ciklusnak vetettük alá oly módon, hogy felváltva —80°C hőmérsékletű etanol-szárazjég keverékbe és 37°C hőmérsékletű vízfürdőbe merítettük. Az S-100 frakciót a lizált baktériumok 4 ml ultracentrifugálásával állítottuk elő; ezt a műveletet egy Beckman SW60 Ti rotorban, pecenként 60 000 fordulattal, 4°C hőmérsékleten egy óra hosszat folytattuk, majd a szupernatáns folyadékot használtuk fel tovább. „B" lízis A „B" lízist a fent leírt „A" lízishez hasonlóan végeztük, azzal az eltéréssel, hogy az 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=8,0) és 30 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldat helyett 50 mmol/1 HEPES (Sigma)-nátrium-kloridot (pH=7,0), 30 mmol/1 nátrium-kloridot, 3 mmol/1 ß-merkapto-etanolt és 3% újszülött borjú szérumot (Gibco) tartalmazó oldatot alkalmaztunk. Ozmózisos sokk. A centrifugálás során kapott sejt-üledéket közvetlenül az elkülönítés és mosás után újból szuszpendáltuk egy 20% szacharózt, 100 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 100 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,4), 1.10'°/ml maximális sejt-sűrűséggel. A szuszpenziót 10 percig jégen tartottuk, majd 10 percig centrifugáltuk percenként 10 000 fordulattal egy Sorvall SS34 rotorban. A szacharózoldatot óvatosan leöntöttük a csőből és az üledéket 52 27 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
