193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 ugyanolyan térfogatú vízben szuszpendáltuk, így a sejtsűrűség újból 1.10‘°/ml volt. Az újból szuszpendált sejteket 10 percig jégen tartottuk, majd ismét 10 percig centrifugáltuk a Sorvall SS34 rotorban percenként 10 000 fordulattal. A szupernatáns folyadékhoz 3% koncentrációig fetális borjú szérumot, 50 mmol/1 koncentrációig HEPES puffert (pH=7), 30 mmol/1 nátrium-kloridot és 3 mmol/1 ß-merkapto-etanolt adtunk. Az így kapott szupernatáns folyadékot („ozmózisos sokk-szuszpernatáns") 0°C hőmérsékleten tároltuk. 3. Lecsapás ammonium-szulfáttal 0. 5 ml kontroli-oldathoz vagy S-100 extrakthoz 1 ml szobahőmérsékleten telített ammonium-szulfát-oldatot adtunk. Az elegyet legalább 30 percig jégen tartottuk, majd a csapadékot egy Eppendorf-centrifugában, szobahőmérsékleten 10 percig folytatott centrifugálással tömörítettük. Az elkülönített üledéket újból feloldottuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid (PBS) oldatban. B) Interferon-titrálások 1. Közvetlen vírus-ellenes vizsgálat A HuIFN-ß meghatározását Sterilin-féle mikrotiter-tálcákon végeztük, a CPE (citopátiás effektus) inhibiciós módszerrel kromoszóma 21-re triszómás humán fibroblasztban. A sejteket felhasználás előtt egy nappal oltottuk a közegre, a minta sorozatos hígításával (log10=0,5) 24 óra hosszat inkubáltuk, majd Indiana-törzsű vezikuláris sztomatitisz-vírussal (VSV) kezeltük; egy olyan vírustörzs-tenyészet 10_3hígításait alkalmaztuk, amely milliméterenként 106’9 C-929 egér plaque-képző egységet tartalmazott. A citopátiás hatást a VSV-kezelés után 24 órával regisztráltuk és az interferon-végpontnak azt a minta-hígítást tekintettük, amely a vírusos citopátiás hatás 50%-os csökkenését eredményezte. Valamennyi meghatározás során egy belső HuIFN-ß standardot is alkalmaztunk, amelyet viszont az USA Nemzeti Egészségügyi Intézet G023-902-527 jelű humán fibroblasztjára kalibráltunk. A kromoszóma 21-re triszómás sejtvonalat (a továbbiakban ezt T2i megjelöléssel említjük) egy Down-féle szindrómában szenvedő nőbetegtől bőr-biopszia útján szereztük. Meghatároztuk ennek a kariotípusát és azt találtuk, hogy diploiditást mutat valamenÿnyi kromoszómára a (triszómás) kromoszóma 21 kivételével. Ennek a sejtvonalnak az interferonnal szembeni érzékenysége összehasonlíthatónak látszik a triszómás sejtvonalak E. Clercq és munkatársai [„Non-antiviral Activities of Interferon are not Controlled by Chromosome 21”, Nature, 256, 132— 134 (1975) és „Chromosome 21 does not co-f de for an interferon Receptor", Nature, 264, 249—251 (1976)] által leírt kromoszóma 2.1 iránti érzékenységével. 53 28 Más ilyen meghatározásokban az E,SM sejtvonalat alkalmazták [A. Billiau és munkatársai: „Human Fibroblast Interferqn for Clinical Trials: Production, Partial Purification and Characterization", Anti-microbial Agents and Chemotherapy, 16, 49—55 (1979)]. Ez a sejtvonal egy diploid fibroblaszt, amely diszómás kromoszóma 21-re és amely egy kéthónapos emberi méhmagzatból származik. A T21 sejtvonallal összehasonlítva, az E^M sejtvonal egy nagyságrenddel, (egy 10-es faktorral) kevésbé érzékeny HuIFN-ß-val szemben. 2. Vizsgálat 2,5-A szintetáz alkalmazásával Egy másik módszer interferon jelenlétének a kimutatására a 2,5-A szintetáz enzim alkalmazásán alapul. Kimutatták, hogy az interferon indukálja ezt az enzimet, amely az adenozin-trifoszfátot (ATP) a 2,5-A trimerjeivé (és kisebb mértékben dimerjeivé, tetramerjeivé és multimerjeivé) alakítja át [A. Kimchi és munkatársai: „Kinetics of the Induction of Three Translation Regulatory Enzymes by Interferon", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.,76, 3208—3212 (1979)]. Az E,SM sejtek (vö.: A. Billian és munkatársai, i.m.) kultúráit tartalmazó konfluens 25 ml-es palackok tartalmát 20 óra hoszszat baktérium-kivonatok vagy kontroli-interferon MEM-10% fetális borjú-szérummal készített 1:6 hígításával kezeltük. A kultúrákat 0,25% tripszinnel és 0,17% etiléndiamin-tetraecetsavval választottuk le, majd 35 millimolos nátrium-klorid-oldattal alaposan mostuk őket. Valamennyi következő műveletet 4°C hőmérsékleten folytattuk le. A sejteket egy Dounce üveg-homogenizátorban, 10 mmol/1 kálium-kloridot, 1,5 mmol/1 magnézium-acetátot és 0,5 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó 20 mmolos HEPES (pH=7,4) pufferoldat (I. 1 ízis-puffér) 1,5—2,0 tf.-nyi menynyiségben homogenizáltuk. A homogenizátumot 20 percig centrifugáltuk 10 000 g-vel, majd a szupernatáns folyadékot (S10) — amennyiben nem azonnal dolgoztuk fel tovább — cseppfolyós nitrogénben tároltuk. Konfluens 96-tartáIyos mikrotiter-lemezekben (0,28 cm2-es tartályonként 105 sejt 0,2 ml folyadékban) a fentebb leírt módon interferonnal vagy megfelelő baktérium-kivonatokkal kezeltük a sejteket. 20 órai kezelés után a lemezeket jégen lehűtöttük, majd háromszor mostuk őket 140 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 35 mmol/-os trisz-pufferoldattal (pH=7,5). A kultúrákat azután oly módon lizáltuk, hogy mindegyik tartályhoz 5 pl 0,5% Nonidet P40-et és 1 mmol/1 fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmazó I. lízis-pufferoldatot adtunk. Jégen 20 percig élénken ráztuk a lemezeket, majd a sejt-lizátumokat összegyűjtöttük és a fentebb leírt módon 20 percig centrifugáltuk 10 000 gvel. A fent leírt módon („A” lízis vagy „B" lízis) előállított 3,5 pl lizátumot 6 pl 54 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
